小麦品种衡观35抗茎基腐病EMS突变及其鉴定

秦鹏亮,周 霄,Kahsay Tadesse Mawcha,王 爽,李佳琪,刘 颖,张 娜,杨文香

(1.河北农业大学植物保护学院植物病理学系/河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心/国家北方山区农业工程技术研究中心,河北保定 071001;2.河北省植保植检总站,石家庄 050000)

0 引 言

【研究意义】由假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)引起的茎基腐病已成为严重危害小麦生产品质的重要病害[1-2]。该病从苗期到成熟期均可发生,造成小麦种植期烂种、死苗,成株期茎基部褐变,发病严重时可见白穗症状,产量减少20%～30%[3]。近些年该病害呈严重发生趋势,2018年在陕西关中的部分地区田块出现30%以上白穗率[4]。2020年山东省发生面积133.33×104hm2(2 000×104亩)以上,河北中南部小麦主产地域2015年部分地块的白穗数量达到50%[5]。应用种植抗病品种是防治该病害的高效、安全、经济的方法,创制抗小麦茎基腐病的种质资源显得非常重要[6]。由优势致病菌假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)引起的茎基腐病已成为影响小麦生产的重要病害。抗病品种的应用是控制该病害高效、安全、经济的方法。但由于小麦抗茎基腐病抗性资源匮乏,创制小麦茎基腐病的抗病种质资源对于培育抗病品种,高效防控小麦茎基腐病具有重要意义。【前人研究进展】化学诱变是资源创制的最有效的方法之一[7]。目前小麦种质资源创新工作中使用最广泛的化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS,Ethyl Methane Sulfonate)具有诱变成本低、操作简单便利、突变率高、对材料的损伤小、不易引起染色体畸变、突变谱较广等特点[8-10],被广泛应用于诱导突变研究中[11-17]。EMS溶液的浓度与处理时间是影响小麦诱变率的关键因素,在EMS诱变浓度与处理时间等做了探索[12]。薛芳等[13]在对新春11号的诱变研究中发现,0.3%是最适宜新春11号小麦的诱变浓度。Mago等[14]用EMS处理小麦种子,选用不同的浓度进行发芽试验,最终以浓度0.4%进行诱变处理,得到一部分突变体。张维宏等[15]用1.0% EMS处理小麦抗叶锈病等基因系TcLr19的种子,通过表型和分子标记辅助筛选,从M3中筛选到了6个TcLr19的感病突变体,为Lr19基因和功能研究提供理想的材料。孙玉龙等[16]采用0.4% EMS诱导盛农1号小麦,经过M3代验证获得可稳定遗传的突变株系18个,为小麦品种改良和遗传研究提供了新的材料。Yasui等[17]利用0.5% EMS处理面包小麦种子,在M2材料中发现了糯质突变体,最终育成了糯质普通小麦新品系K107wx1和K107wx2。EMS诱变可以产生较为丰富的突变后代,而且不同的品种诱变的最佳EMS浓度不同。【本研究切入点】经过适宜浓度的EMS诱变可筛选得到一些抗病材料。然而高效准确的接种鉴定方法是筛选抗病材料的关键环节之一。霍燕等[18]比较了培养皿幼苗直接接种培养法、水培苗接种法、棉球接种法和菌液浸种接种法4种接菌方法,发现棉球接菌法为最佳的接种方法。在苗期鉴定病级是判断小麦茎基腐病发病严重性有效的方法之一,苗期鉴定结果与成株期鉴定结果具有较高的相关性[11],但由于发病程度受多种因素的影响,苗期鉴定的结果与成株期的鉴定结果可能存在一定差异。需研究小麦品种衡观35抗茎基腐病EMS突变及其鉴定。【拟解决的关键问题】采用在河北主麦区大面积种植的小麦品种衡观35为诱变品种,参照张纪元等[19]方法通过对EMS最佳处理浓度的筛选。筛选出适宜的诱变浓度,通过湿纸巾接种法[20]和棉球接种法[18]接菌并于后期对小麦抗茎基腐病抗病突变材料进行抗病性鉴定分析,明确其抗病特性,对诱变材料进行加代繁殖,同时跟踪鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

以感茎基腐病小麦品种衡观35为诱变材料,非诱变的衡观35为感病对照,石优17为中抗对照。

所用药品、试剂:EMS试剂(ALFA AESAR(A Johnson Matthey Company))、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和硫代硫酸钠(Na2S2O3)(天津福晨化学试剂有限公司)。

假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum, Fp)为致病力强菌株,由河北农业大学植物保护学院小麦创新团队实验室保存。

1.2 方 法

1.2.1 小麦品种的诱变处理

选取籽粒饱满的感病材料衡观35种子 2 000粒,先用75%酒精对种子进行消毒,再用灭菌水清洗3次,将衡观35种子在室温条件下分别放入配置好的EMS磷酸缓冲液浓度为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的溶液中,在26℃下110 r/min,振荡处理8 h,加入5%硫代硫酸钠进行终止反应,用流动的自来水冲洗3次,每次间隔15 min。放入4℃冰箱中,3 d后观察并统计其萌发率。以磷酸缓冲液浸泡的种子作为对照。通过不同浓度EMS对小麦萌发率的影响,选择相对萌发率为50%左右的浓度作为最适诱变浓度。

1.2.2 假禾谷镰刀菌悬浮液的制备

根据王佐乾等[21]方法制备绿豆培养基,经121℃灭菌30 min。用灭菌的打孔器在PDA培养基上扩繁的Fp菌种,将5个菌饼转移至绿豆汤培养基,28℃条件下180 r/min振荡培养72 h,之后将纱布折叠成多层用于过滤,在显微镜下用血球计数板观察并计算孢子浓度,调节菌液孢子浓度至106/mL。

1.2.3 诱变后小麦萌发种子的接种鉴定

小麦萌发后,采用湿纸巾法[20]对其接种,待其芽长至5 mm左右,筛选萌发率较好的小麦种子浸于孢子悬浮液中,接种10 min后,将种子呈直线均匀置于灭菌的湿润纸巾上,芽的生长方向一致,指向纸巾边缘,芽上端离纸巾边缘2 cm左右,将纸巾从一端向另一端卷起,然后将其置于泡沫盒中,在22～25℃,90%的相对湿度环境中进行培养。小麦成功接菌35 d后,参考Wildermuth[22]的改进方法进行鉴定。采用5级鉴定标准对每个品种的处理的苗子进行鉴定,0级为未发病;Ⅰ级为第一叶鞘病斑长度小于1.0 cm;Ⅱ级为第一叶鞘病斑长度在1.0～2.0 cm;Ⅲ级为第一叶鞘病斑长度大于2.0 cm,幼苗未萎蔫;Ⅳ级为幼苗出现萎蔫病症;Ⅴ级为幼苗死亡。

1.2.4 突变材料的加代

采用0.4% 的EMS对衡观35进行诱变,将诱变后的M0幼苗采用Li等[24]的方法接种假禾谷镰刀菌的悬浮液,在接种35 d后对品种M0的发病级别进行鉴定,M0抗病的幼苗转入花盆,低温处理后完成春化,转至温室进行加代。收获后继续加代,直至获得M3代。

1.2.5 诱变加代幼苗的接菌

经温室加代培养筛选获得M3代的种子播种于盆中,在小麦播种15 d左右后,挑选健康、长势相似的小麦,采用棉球接种法[18]在距土表0.5～1 cm的茎基部缠绕适量医用脱脂棉球,用移液枪在棉球内侧与茎基部接触的地方注射0.5 mL菌液,后用适量的保鲜膜包裹润湿的脱脂棉球,外再缠绕适量透明胶带进行固定,于20℃条件下进行迷雾保湿72 h。在小麦成功接菌35 d后,将麦苗轻轻拔出然后冲洗干净,查看病害等级程度,根据改进后Wildermuth[22]方法鉴定。

健康的植株继续生长到成株期,利用Raju等[23]鉴定标准进行鉴定。0级:茎基部无腐烂坏死病斑;Ⅰ级:第一茎节局部腐烂;Ⅱ级:第一茎节完全腐烂,第二茎节局部腐烂或完全腐烂;Ⅲ级:腐烂症状上升至第二茎节及以上;Ⅳ级:麦穗以下腐烂;Ⅴ级植株整株死亡或不抽穗或白穗。

病情指数=(∑(各级病株数×相对级数值) /调查总株数×最高病级)×100。

采用0.4% 的EMS对衡观35进行诱变,将诱变后的M0幼苗采用Li等[24]的方法接种假禾谷镰刀菌的悬浮液,在接种35 d后对品种M0的发病级别进行鉴定。

1.3 数据处理

收获M3成熟小麦种子进行千粒重测定。采用SPSS 19.0软件对病情指数和千粒重进行Duncan＇s新复极差法方差分析。

2 结果与分析

2.1 适宜EMS处理浓度的确定

研究表明,小麦品种衡观35经0.4% EMS诱变后其萌发率为49.00%(相对萌发率为52.13%),其它浓度造成萌发率偏低,衡观35诱变适宜浓度为0.4%。

2.2 苗期病级鉴定

研究表明,品种M0衡观35 中0级株数最多,共计106株,占突变总株数的14.50%,并且比两个对照组高出3倍。M0衡观35的病情指数比中抗品种石优17低19.02%。表1

表1 M0小麦人工接菌后苗期的病级鉴定

对选择出0～Ⅱ级的材料进行繁殖,保留病害Ⅱ级以下的材料,收获种子,繁殖直至M3代。对M3代的小麦粒播种,进行苗期接菌鉴定,从120株M3衡观35中获得25株免疫材料,占该品种突变材料的20.83%,比对照感病衡观35和中抗石优17免疫株数所占百分比分别高出1倍和3倍。M3衡观35苗期的病情指数显著低于对照感病衡观35的病情指数,并且与对照中抗石优17的病情指数没有显著性差异。M3衡观35品种在苗期能够抵抗茎基腐病的发生。表2,图1

A:衡观35;B:M3衡观35;C:石优17

表2 M3突变品种苗期病级鉴定

2.3 M3突变品种成株期病级鉴定结果

研究表明,M3衡观35各发病等级株数有所变化,病情指数高于苗期的病情指数,但与对照感病衡观35的病情指数存在显著性差异,小麦茎基腐病发生的严重程度随着生育期的延长而加重,共获得突变免疫抗性资源7株,占测试突变株材料的5.83%。表3和图2

注:A:衡观35;B:M3衡观35;C:石优17

表3 M3突变品种成株期病级鉴定

2.4 M3突变株的农艺性状和抗茎基腐病材料的千粒重变化

研究表明,小麦品种衡观35的EMS诱变突变株在农艺性状和抗病性上均发生了变化。在测试的小麦突变材料中,植株出现抽穗晚、矮化、分蘖增多及畸形穗等症状。与对照相比,M3衡观35小麦抗茎基腐病的病能力增强,而且同一小麦品种千粒重随其病害级别的增大而降低,与感病衡观35和中抗石优17对照相比,同一病害等级下的不同品种间千粒重差异显著。图3,表4

注:A:少分蘖;B:半矮化;C:少分蘖、抽穗晚;D:抽穗晚,冬性增强;E:畸形穗

表4 M3突变品种不同病害级别的千粒重变化

3 讨 论

3.1EMS诱变剂是目前最为有效的植物化学诱变技术方法之一[8]。目前利用该技术获得抗性基因突变体,Mago等[25]报道,利用EMS诱导在基因组中产生随机点突变获得抗锈病基因敏感型突变体。李韬等[26]使用EMS对抗赤霉病的小麦地方品种进行诱变处理,发现处理小麦的发病率都比相应株野生型的高得多。赵天祥等[27]利用EMS技术对小麦偃展4110种子进行诱变,对其M2代整个的生育期田块表现型进行抗性鉴定及实时观察,从而其获得了特殊性状的突变体。

3.2温日宇等[28]用EMS 处理后使藜麦幼苗种子细胞产生许多生理生化反应,生成了大量有害自由基及其他分子。而在诱变剂过程中,其化学诱变物质会导致植物内部的生理损伤,在某种程度上,增加诱变剂剂量和延长诱变剂处理的时间可能会提高诱变剂的效力;当其诱变剂的剂量超过剂量限制时,植物本身就会受到严重的生理损害,导致更多的死亡和失常。现已知EMS诱变对种子的萌发产生一定的影响。EMS作为应用最广、效果最好的诱变剂,已经用于多种作物的诱变育种及抗病选择。卢银等[29]采用不同浓度 EMS 诱变大白菜种子萌发及幼苗生长的研究,发现诱变的最佳浓度为 0.4%～0.6%。曲高平等[30]用不同浓度的EMS处理甘蓝油菜种子发现随着 EMS浓度的增大,发芽率降低,发芽时间延长。研究采用不同浓度EMS对衡观35进行诱变来筛选茎基腐抗性突变体,试验选择了0.4%、0.6%、0.8%和1.0% 4个浓度的诱变试验,随着EMS浓度的提高,种子的发芽率降低,考虑到诱变效率,以小麦的相对萌发率在50%左右,确定处理组小麦品种衡观35的诱变适宜浓度为0.4%,获得了抗茎基腐病免疫突变株M0衡观35。经温室盆栽进行加代繁殖,以病害级别为选择依据,得到M3代。对于M3代的苗采用霍燕等[18]方法接菌,分别于苗期和成株期鉴定病级筛选抗病资源,共从供试突变品种M3代中筛选获得7份免疫的抗小麦茎基腐病的资源。发现突变获得的M3材料在鉴定中仍然存在免疫和不同级别的抗病性,可能是由于决定小麦茎基腐病抗病性的基因是微效基因决定的。而金京京[31]通过对普通小麦品种抗茎基腐病全基因组关联分析筛选出的04中36和石优17等抗性品种丰富了我国小麦茎基腐病抗病资源,并筛选出抗病相关蛋白及其编码基因。Yang等[32]通过EMS诱变建立突变体库,利用GWAS(Genome-wide association study)和QTL定位分析发现了小麦茎基腐病相关基因TaDIR-B1,并通过基因沉默技术,发现该基因的功能缺失能显著增强小麦茎基腐病的抗病能力,且可能通过调节植株中木质素含量来调控植株抗病能力。然而参与小麦茎基腐病调控基因的表达受环境的影响,或者目前所得到的M3代尚不稳定,需要后期通过分子技术进行进一步的确认。

3.3此外,许云峰等[33]利用EMS处理小麦品种烟农15,得到了一些具有不同性状的突变体,而且出现了一些优良农艺性状突变。

4 结 论

4.1在苗期表现免疫的植株,有些到成株期则不再表现免疫,鉴定中发现苗期抗病性和成株抗病性存在差异,随着接种时间的延长,病害发生程度加重,成株期测试的突变植株仅为7株表现免疫,成株期的鉴定结果更能代表植株的抗病性。

4.2EMS突变小麦衡观35,适宜的突变浓度为0.4%,共从供试突变品种M3代中筛选获得了7份免疫的抗小麦茎基腐病的资源。