新型转基因高产棉花萌发期和苗期耐盐性与耐碱性评价

宋冰梅,姜 岩,陈 鑫,3,张 宇,程宛楠,潘洪生

(1.新疆大学生命科学与技术学院/新疆生物资源和基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046;2.新疆农业科学院植物保护研究所/国家植物保护库尔勒观测实验站,乌鲁木齐 830091;3.新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心,乌鲁木齐 830052;4.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

0 引 言

【研究意义】2021年新疆棉花种植面积占全国的82.8%[1]。转Bt(Bacillusthuringiensis)基因棉花商业化种植[2],相对于非转基因棉花其具有抗虫、增产、减少化学农药使用量等优势[2-3],且增加单位面积棉花产量[4]。棉纤维长度是影响棉花产量和品质的关键因素,Bn-csRRM2(RNA recognition motif 2 ofBrassicanapus)过表达能够抑制棉花细胞周期进程,从而调节细胞大小使其纤维长度显著高于亲本对照[5]。2012年中国农业科学院棉花研究所将Bn-csRRM2转入我国主栽棉花中棉所12号(CCRI-12)中获得转Bn-csRRM2基因高产棉花HN9311[6],其铃重、总铃数、籽棉产量、皮棉产量均显著高于中棉所12号的[7]。【前人研究进展】盐碱胁迫影响着全球约10×108hm2的干旱和半干旱地区,也是影响农作物产量的重要因素之一[8],每年造成农作物产量的损失达273×108美元[9]。新疆土地盐碱化程度较重,盐渍化土壤面积为2181.4×104hm2,占全国盐渍土面积的22.01%,其中盐碱化的耕地达122.88×104hm2[10]。棉花植株对盐碱胁迫具有一定的抵抗能力,但土壤中盐碱的积累仍然会减少其对水分和养分的吸收[11]。在盐碱胁迫下棉花的根长、株高、种子萌发和果实发育等直接指标会显著下降[12],其生长发育受到较大影响[13]。土壤盐渍化能够导致棉花产量降低50%～60%[14],其程度与棉田出苗率和产量显著负相关[15]。如若0～100 cm土层(根区)脱盐率为24.93%,棉花成活率便能从1.48%提高到42.04%,产量从72.43 kg/hm2增加到3 075.90 kg/hm2[15]。【本研究切入点】不同棉花品种的耐盐碱性差异较大且耐盐碱胁迫能力与生长发育阶段密切相关[16-18]。萌发期和苗期是棉花生长的关键时期[19],两个时期的棉花对盐碱胁迫最为敏感[20]。Bn-csRRM2基因属于外来基因,被转入棉花后会打破其固有的生长发育与新陈代谢模式。因此,在盐碱胁迫下HN9311与亲本对照相比,其生长发育状态及耐盐碱性都有可能发生改变。目前,关于转Bn-csRRM2高产棉花HN9311的研究主要集中在其对棉田微生物[21]、昆虫等生物群落的影响[6,22],关于盐碱胁迫对其萌发期和苗期的影响尚未见报道。【拟解决的关键问题】研究以转Bn-csRRM2基因高产棉花HN9311和中棉所12号(亲本对照)为研究对象,以直接指标和相对指标作为评价标准,研究盐胁迫和碱胁迫对其萌发期和苗期生长发育的影响及其耐盐与耐碱性,以期为新型转基因高产棉花的商业化种植提供重要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用NaCl和NaHCO3均购自天津博迪化工有限公司,Hoagland's营养液参照付媛媛等[23]配方自行配制;新型转基因高产棉花HN9311和中棉所12号均由中国农业科学院棉花研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 萌发期耐盐性和耐碱性评价

试验在国家植物保护库库尔勒观测实验站(新疆巴州库尔勒市和什力克乡库勒村,41°45′00″N,85°48′60″E)进行,试验方法参照张国伟等[24]并改进。挑选100粒饱满的棉花种子,用150 mmol/L的NaCl溶液或70 mmol/L的NaHCO3溶液浸泡12 h(分别以去离子水作为对照),待其吸足水分后放置于铺有2层定性滤纸的发芽盒(19 cm × 13 cm × 5 cm)内,随后加入20 mL浸泡时所用溶液,每处理组重复4次。发芽盒上覆盖保鲜膜保湿,1～4 d将其分别放置于温度(25±1)℃、相对湿度50%和无光照的人工气候箱内催芽,第5 d后开始每天以400～600 μmol/(m2·s)光照14 h,每天10:00补充蒸馏水以保持滤纸湿润,第3～7 d统计种子发芽数,并在第7 d每个重复选取4个芽苗测定其下胚轴长、根长和鲜质量。

1.2.2 苗期耐盐性和耐碱性评价

试验在温度(25±1)℃、相对湿度50%、光照频率14L∶10D和光强400～600 μmol/(m2·s)的人工气候箱内进行。在底部具孔的营养钵(高12 cm、直径10 cm)中放入一定重量蛭石(基质含水量35%)并播入3粒饱满且无裂口的棉花种子(播种深度一致),出苗后每个营养钵留1株长势一致的棉苗,将其置于30 cm×15 cm的托盘中。每盘放置12株,盘中注入1 L含有NaCl(150 mmol/L)或NaHCO3(70 mmol/L)的Hoagland's营养液,分别以不含有NaCl或NaHCO3的Hoagland's营养液作为对照(CK)。试验期间每个托盘每天10:00补充去离子水,每隔5 d补充1次营养液,每个处理重复4次。于处理第21 d(大约5叶期)时每个重复选取4株测定其真叶数、株高、根长、根鲜重量和地上部鲜重量。

1.3 数据处理

测量直接指标,计算发芽势、发芽率和活力指数以评价盐胁迫和碱胁迫对HN9311萌发期和苗期生长发育的影响;计算相对指标、相对盐/碱害率,评价HN9311萌发期和苗期耐盐/碱胁迫能力。

鲜重量=地上部鲜重量+根鲜重量;

根冠比=根鲜重量/地上部鲜重量;

发芽势=第3d发芽种子数/供试种子总数×100%;

发芽率=7d内发芽种子数/供试种子数×100%;

发芽指数=ΣGt/Dt(式中,Gt为时间t的发芽数,Dt为相应的发芽天数);

活力指数=S×发芽指数(式中,S为芽苗的鲜质量);

相对指标=实验组测定值/对照组测定值;

相对盐/碱害率=(对照组发芽率-实验组发芽率)/对照组发芽率×100%。

采用Microsoft Excel 2021、SPSS 20和Origin 2022进行数据的统计、分析和图表制作。盐/碱胁迫下HN9311萌发期和苗期直接指标均符合正态分布(峰度和偏度系数法)和方差齐性(One-way ANOVA检验),采用Duncan新复极差法进行多重比较;盐/碱胁迫下HN9311萌发期和苗期相对指标和相对盐/碱害率均符合正态分布,采用参数独立样本T检验法检验,仅苗期盐胁迫下相对株高不符合正态分布通过非参数Mann-Whitney检验。

2 结果与分析

2.1 盐/碱胁迫对HN9311萌发期和苗期直接指标的影响

研究表明,对照组(0 mmol/L NaCl与0 mmol/LNaHCO3)之间HN9311直接指标均无显著性差异(P>0.05)。盐胁迫和碱胁迫下HN9311鲜重量(F=55.49,df=3,15,P<0.001)、下胚轴长(F=5.80,df=3,15,P=0.011)、根长(F=951.82,df=3,15,P<0.001)、发芽势(F=1216.05,df=3,15,P<0.001)、发芽率(F=662.00,df=3,15,P<0.001)、发芽指数(F=3807.30,df=3,15,P<0.001)和活力指数(F=305.67,df=3,15,P<0.001)均显著下降。盐胁迫下HN9311发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数的下降程度均显著高于碱胁迫,碱胁迫下根长的下降程度显著高于盐胁迫。表1

表1 盐/碱胁迫下新型转基因高产棉花HN9311萌发期直接指标变化

对照组(0 mmol/L NaCl与0 mmol/L NaHCO3)之间HN9311直接指标均无显著性差异(P>0.05)。盐胁迫和碱胁迫下HN9311根冠比显著增强(F=110.40,df=3,15,P<0.001),株高(F=70.06,df=3,15,P<0.001)、根长(F=125.58,df=3,15,P<0.001)、根鲜重(F=126.04,df=3,15,P<0.001)、地上部鲜重(F=524.84,df=3,15,P<0.001)和鲜重量(F=456.49,df=3,15,P<0.001)均显著下降,真叶数(F=12.02,df=3,15,P=0.001)仅在碱胁迫下显著下降。除根冠比以外,碱胁迫下所有直接指标下降程度均显著高于盐胁迫。盐/碱胁迫对HN9311萌发期和苗期的生长具有显著的抑制作用,苗期对碱胁迫比盐胁迫更为敏感。表2

表2 盐/碱胁迫下新型转基因高产棉花HN9311苗期直接指标变化

2.2 盐/碱胁迫对HN9311萌发期和苗期相对指标的影响

研究表明,盐胁迫下HN9311萌发期相对鲜重量(T=3.45,df=6,P=0.014)、相对发芽势(T=12.88,df=6,P<0.001)、相对发芽率(T=4.12,df=6,P=0.006)、相对发芽指数(T=11.00,df=6,P<0.001)和相对活力指数(T=8.05,df=6,P=0.001)均显著低于中棉所12号;碱胁迫下HN9311相对下胚轴长(T=5.63,df=6,P=0.004)、相对发芽指数(T=3.46,df=6,P=0.013)均显著高于中棉所12号,相对鲜重量(T=9.82,df=6,P<0.001)显著低于中棉所12号。盐胁迫下HN9311苗期相对根鲜重(T=7.73,df=6,P<0.001)、相对地上部鲜重(T=3.55,df=6,P=0.012)和相对鲜重量(T=5.14,df=6,P=0.002)显著低于中棉所12号;碱胁迫下HN9311相对根冠比(T=12.80,df=6,P<0.001)显著高于中棉所12号,相对株高(T=3.60,df=6,P=0.023)、相对根鲜重(T=13.82,df=6,P=0.004)、相对地上部鲜重(T=16.75,df=6,P<0.001)和相对鲜重量(T=16.47,df=6,P<0.001)均显著低于中棉所12号。HN9311萌发期耐盐胁迫能力和苗期耐盐/碱胁迫能力均低于中棉所12号。表3,表4

表3 盐/碱胁迫下新型转基因高产棉花HN9311萌发期相对指标变化

表4 盐/碱胁迫下新型转基因高产棉花HN9311苗期相对指标变化

2.3 盐/碱胁迫对HN9311相对盐/碱害率影响

研究表明,HN9311相对盐/碱害率分别为27.0%、21.0%,中棉所12号分别为22.75%、23.00%,其中HN9311相对盐害率显著高于中棉所12号的(T=3.47,df=6,P=0.013),其相对碱害率与中棉所12号的无显著性差异(P>0.05),HN9311萌发期耐盐胁迫能力低于中棉所12号的。图1

注:*、ns分别代表HN9311与中棉所12号相对盐害率具有(P<0.05)或不具有(P>0.05)显著性差异(独立样本T检验法检验)

3 讨 论

3.1通过直接和间接鉴定法[19]研究了盐/碱胁迫对HN9311萌发期和苗期生长发育的影响并对其耐盐/碱胁迫能力进行了评价。研究表明,与中棉所12号相比,除真叶数和根冠比以外,HN9311萌发期和苗期各项直接指标均显著下降,苗期对碱胁迫比盐胁迫更为敏感,并且HN9311萌发期耐盐胁迫能力和苗期耐盐/碱胁迫能力均低于中棉所12号的。

3.2植物的盐碱应激反应是一个极为复杂的过程,涉及到转录和代谢等方面[25-26]。因此通常利用植物生长过程中的生理指标来评价盐碱胁迫下植物生长发育的复杂情况以及其耐盐碱胁迫能力[3,27-28],其中鲜重量、发芽势、发芽率、根长、下胚轴长、发芽指数和活力指数是评价萌发期棉花生长状态的重要直接指标,其数值大小与萌发期棉花生长发育情况以及耐盐碱胁迫能力正相关[29-31]。研究发现,在盐/碱胁迫下HN9311萌发期所有直接指标均显著下降,其种子质量被显著抑制且萌发期的生长发育受到较大影响。

3.3真叶数、株高、根长、根鲜重、地上部鲜重、鲜重量和根冠比指标的结合,从根质量到地上部质量全面的反映了棉花苗期生长发育情况,其数值的变化被广泛用于评价盐碱胁迫对棉花苗期生长发育的影响程度[32-33]。其中根是植物与盐渍化土壤第一个直接接触的器官,直接受到盐碱胁迫的危害,其生长、形态都受到影响[34]。植物面对盐碱胁迫形成了一定的适应机制,如通过减少地上部的生物量、减少水分和营养消耗等。因此植物地上部比地下部对盐碱胁迫更为敏感[35],在一定盐碱浓度范围内根冠比的大小与受盐碱胁迫程度以及植物耐盐碱胁迫能力负相关[16,36]。在研究盐碱胁迫浓度下,根冠比显著高于对照组,HN9311通过增大根冠比来保证逆境情况下水分与营养的需求;除真叶数和根冠比以外,其余直接指标在盐胁迫和碱胁迫情况下均显著低于对照组,盐/碱胁迫对HN9311苗期的生长发育也有显著的影响。NaHCO3较NaCl能够提供额外的pH胁迫[37-39],在含Na+离子浓度相同情况下,碱性土壤对植物的胁迫程度大于盐性土壤。通过比较盐/碱胁迫下各项直接指标下降程度,得到苗期碱胁迫对棉花生长的抑制程度大于盐胁迫的结论,与苏孟杞[40]研究一致。

3.4相对指标可以消除棉花品种导致的种间直接指标的差异,其数值大小可以评价不同品种棉花之间耐盐碱胁迫能力差异[19,41]。研究发现,在同样的盐胁迫和碱胁迫条件下,除萌发期碱胁迫下相对下胚轴长和相对发芽指数,以及苗期碱胁迫下相对根冠比以外,HN9311萌发期和苗期所有相对指标均显著小于或等于中棉所12号,并且相对根冠比同样与耐盐碱胁迫能力负相关,外来Bn-RRM2基因影响了棉花耐盐/碱性,使其萌发期耐盐胁迫能力和苗期耐盐/碱胁迫能力均低于亲本对照的。目前,分子层面上盐碱胁迫对棉花生长发育的影响尚未被全面阐述[18],Bn-RRM2基因对棉花耐盐碱胁迫能力的影响也有待于探索。相对盐/碱害率可评价盐/碱胁迫下植株被危害的等级[42],其数值越大棉花生长发育被抑制程度越大[20,43]。HN9311萌发期相对盐/碱害率分别为27.00%、21.00%,中棉所12号分别为22.75%、23.00%,在试验盐/碱浓度下两者受盐/碱胁迫程度不大。由于HN9311相对盐害率数值显著大于中棉所12号,HN9311萌发期耐盐胁迫能力显著小于中棉所12号。

3.5在适宜盐碱浓度下植物会加快萌发,当浓度超过阈值时盐碱会抑制其生长[44]。棉花耐盐阈值为77 mmol/L NaCl,采用150 mmol/L NaCl来鉴定棉花耐盐性[44-46],研究盐胁迫条件设定为150 mmol/L NaCl。盐渍土形成的原因是多种因素共同作用的结果[47],其形成因素不稳定导致新疆各地区土壤中的盐碱离子浓度差异较大[48],并且NaCl和NaHCO3是新疆盐渍土壤中两种并存的典型化合物[49]。单一浓度和单独的盐/碱胁迫设定不能全面反映土壤中的盐碱对HN9311生长发育的影响,以后可设计多个浓度梯度并且增加NaCl+NaHCO3复合试验来进一步完善研究结果。研究为室内试验相较于田间试验环境较为稳定,在田间试验过程中HN9311的生长发育会受到多个因素如雨水、温度等的影响,中棉所12号为盐敏感品种[50-51],HN9311同样为盐敏感品种。盐/碱胁迫对HN9311产量的影响可能较大,有待于进一步研究。

4 结 论

与中棉所12号相比,除真叶数和根冠比以外,HN9311萌发期和苗期各项直接指标均显著下降,盐/碱胁迫对HN9311生长发育均具有显著的抑制作用并且其苗期对碱胁迫比盐胁迫更为敏感。HN9311萌发期相对盐/碱害率分别为27.00%、21.00%,中棉所12号分别为22.75%、23.00%,其萌发期耐盐胁迫能力和苗期耐盐/碱胁迫能力均低于中棉所12号。