不同微生物菌处理对番茄土壤微生物多样性的影响

王丹丹,李 燕,张庆银,李世东,庞永超,马琨芝,马 龙,牛瑞生,钟增明,齐连芬,师建华

(1.石家庄市农林科学研究院,石家庄 050041;2.中国农业科学院植物保护研究所,北京 100091;3.高邑县农业执法大队,河北高邑 051330;4.高邑县农业技术推广中心,河北高邑 051330,5.北京启高生物科技有限公司,北京 100000)

0 引 言

【研究意义】番茄是世界范围内栽培面积最广的蔬菜作物之一[1-4]。连作种植,土壤连作会造成番茄产量下降、品质不佳、生长状况变差、土传病害严重等。研究不同微生物菌处理对番茄土壤微生物的影响,对改善土壤微生物多样性、提高产量有实际意义。【前人研究进展】马云华等[5]、孙艳艳等[6]研究表明随着黄瓜、番茄连作茬次的增加,根际土壤微生物由细菌型向真菌型过渡;而与细菌相比,真菌的繁殖不需要活体细胞提供营养,因此,其传播途径更广、速度更快,对植株产生的危害也就更严重[7]。通过改良土壤、调整土壤微生态环境,可以明显改善土壤连作障碍造成的一系列问题[8]。土壤微生物是土壤中肉眼看不到的细小生物的总称,是土壤不可或缺的重要组成部分,土壤微生物群落的组成和多样性会影响番茄的生长、产量、土传病害发生的程度等[9-12]。微生物可提高土壤酶的活性、增加土壤微生物的复杂性、改善土壤的抗逆能力[13],近年来常被用于改良土壤微生态环境及防治土传病害问题[14,15]。目前,放线菌已在番茄[16]、甜瓜[17]、辣椒、茄子[18]得到应用,枯草芽孢杆菌已在番茄[19]、黄瓜[20]、枸杞[21]等上应用,哈茨木霉菌已在茄子[22]、马铃薯[23]、苹果[24]上应用。【本研究切入点】微生物菌处理对番茄土壤微生物群落影响的研究已有较多报道,但多种微生物菌处理连作番茄土壤对土壤微生物群落多样性及与番茄生长相关性的分析较少。需评估不同微生物菌处理对番茄土壤微生物多样性的影响。【拟解决的关键问题】研究放线菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌3种微生物菌剂处理连作栽培番茄土壤微生物多样性、与番茄生长相关性,筛选适宜的微生物菌剂,为促进土壤生态修复、改善番茄根系环境提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验在石家庄市农林科学研究院赵县3号温室进行。试验温室肥力中等,地力均匀,水利条件良好。

供试番茄品种为农博粉18109,由石家庄市农林科学研究院提供,穴盘苗由河北省石家庄市高邑鄗丰种苗公司代育。

放线菌(密旋链霉菌及娄彻氏链霉菌活性孢子)购自陕西博秦生物工程有限公司,有效活菌数≥20×108/g;枯草芽孢杆菌由中国农业科学院,北京启高生物科技有限公司联合研发,有效活菌数≥2.0×108/g;哈茨木霉由中国农业科学院植物保护研究所研制、海南金雨丰生物工程有限公司出品,有效活菌数≥2.0×108/g;大量元素水溶肥(N-P2O5-K2O为12-6-40)由四川农业大学研制、四川爱隆植物营养科技有限公司生产。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

设置4个处理,CK对照为常规施肥(冲施大量元素水溶肥),T1为常规施肥+放线菌、T2为常规施肥+枯草芽孢杆菌、T3为常规施肥+哈茨木霉,3种菌剂施用量依菌剂活性而定,均于定植前撒施于栽培垄内。每个处理3次重复,随机区组排列,共12个小区,小区面积16 m2。行距为大小行90 cm×70 cm,株距40 cm,2021年3月18日定植,单秆整枝,每株留5穗果,2021年7月10日拉秧。

1.2.2 土壤样品采集

于番茄的拉秧期采集根围土壤样品 (根围2 cm),采用五点取样法进行采样。将采集的土壤样品置于无菌自封袋低温(干冰)保存并运送至实验室,然后存储于-80℃超低温冰箱保存用于微生物多样性测定。

1.2.3 测定指标

土壤微生物多样性:可以根据不同的相似度水平,对所有序列进行OTU划分,每个OTU对应于一种代表序列。该方法能提高测序分析的准确性[25]。将采集的土壤样品送至深圳微科盟科技集团有限公司,采用Illumina MiseqTM测序技术进行测定,对细菌的16S rRNA基因和真菌 ITS 基因扩增及测序,通过Reads拼接、过滤、去嵌合体等数据预处理,对有效数据进行操作分类单元(OTU)聚类,进行物种注释及丰度分析,并进行Alpha多样性分析、βeta多样性分析和显著物种差异分析等。

株高:用卷尺测量植株最下部到最上部的距离。茎粗:游标卡尺测量最上面一穗花的下部茎的粗度。叶长、叶宽:直尺测量成熟叶片的最大叶长和叶宽。产量:电子秤称重测量。

1.3 数据处理

用Qiime软件构建UPGMA样本聚类树。采用SPSS18.0进行统计分析和方差分析,用Microsoft Excel 2010进行绘图,LEfSe软件估算相对丰度差异。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物数量

研究表明,T3处理的细菌含量最多,为109.8×107CFU/g,显著高于对照和T2,T2的细菌含量最少。T1的真菌含量最高,为48.6×105CFU/g,与对照和T2间无显著差异,但显著高于T3。除T2处理外,其他处理的细菌和真菌比例均大于对照。表1

表1 土壤中的微生物数量

2.2 OTU聚类分析

研究表明,4个处理的细菌共有的OTUs为1 410个,CK、T1、T2、T3的OTU分别为2 344、2 430、1 845、2 513个,T1和T3的细菌种类多于CK,而T2的细菌种类少于CK,是由于T1和T3的微生物菌里含有糖类、蛋白质等易被细菌利用的物质利于细菌繁殖。真菌共有的OTUs为85个,CK、T1、T2、T3的OTU分别为157、139、98、133个,微生物菌处理的真菌种类均少于对照。图1

图1 土壤中细菌和真菌的OTU分布

2.3 不同微生物菌处理对番茄土壤微生物Alpha多样性的影响

研究表明,T2处理的Shannon和Simpson指数均低于对照,T1和T3处理的Shannon和Simpson指数均高于对照,放线菌和哈茨木霉的施用可以增加土壤微生物的丰富度和均匀度,而枯草芽孢杆菌的施用未增加土壤微生物丰富度和均匀度。放线菌和哈茨木霉的施用均能提高土壤细菌群落的多样性。图2

图2 细菌SHANNON (A)和SIMPSON (B)指数变化

放线菌、枯草芽孢杆菌和哈茨木霉处理后的Shannon和Simpson指数均高于对照,放线菌、枯草芽孢杆菌和哈茨木霉处理均提高土壤中真菌群落的多样性。图3

图3 真菌Shannon (A)和Simpson (B)指数变化

2.4 不同微生物菌处理对番茄土壤微生物Beta多样性的影响

研究表明,对照、放线菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉4个处理中3个重复的微生物菌群均能聚于一个区域,各个处理明显分开,不同处理细菌间存在差异,相同处理间存在较强的一致性。对每个处理3次重复取均值,T1和T3首先聚为一类,然后和CK聚为一类,最后和T2聚为一类,T1和T3微生物菌处理的细菌多样性较为相似,T1、T3与T2微生物菌处理的细菌多样性相似性较差。图4,图5

图4 细菌NMDS分析

图5 细菌属水平聚类热图

各个样本在图中的分布较为分散,4个处理间的区分度较差,不同处理之间的真菌多样性的差异较小。CK和T2首先聚为一类,T1和T3聚为一类,最后两类聚为一类。T1和T3微生物菌处理的真菌多样性较为相似。图6,图7

图6 真菌NMDS分析

图7 真菌属水平聚类热图

2.5 不同微生物菌处理后番茄土壤微生物群落组成

研究表明,细菌中Unspecified_iii1_15、Unspecified_RB41、Unspecified_Gemm_5、Unspecified_Syntrophobacteraceae、Kaistobacter为优势细菌属。图8B真菌中Fusarium(镰刀菌属)、Unspecified_Chaetomiaceae(未分类毛壳菌科)、Unspecified_Pezizales、Unspecified_Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Mortierella(被孢霉属)为优势真菌属,4个不同处理均是镰刀菌属(Fusarium)的相对丰度最高,分别为73.63%、61.53%、69.67%、65.32%,其次均为未分类毛壳菌科,相对丰度分别为17.06%、24.59%、21.68%、25.03%。图8

图8 土壤微生物群落在属水平上的相对丰度

2.6 与环境因子的RDA分析

研究表明,细菌和真菌的3个重复点距离较近,重复性好,类群组成相似,且P值均小于0.01,微生物群落变异的解释方差极显著。主成分1、2对细菌群落差异的解释贡献率值分别为25.95%和23.25%,对细菌群落差异的解释贡献率值分别为28.94%和25.00%。细菌和真菌的RDA分析中叶宽的箭头均最短,叶宽与微生物群落分布间的相关性最小,叶长、株高、茎粗和产量与微生物群落分布间的相关性高;细菌分析中叶长和株高间夹角为锐角,叶长和株高间的相关性高,而两者与产量间的相关性低;真菌分析中叶长与叶宽、株高、茎粗间的夹角都为锐角,叶长与这三者间的相关性高,与产量间的相关性低。叶长和株高处于CK象限内,这两者与CK的相关性最高,茎粗与T1的相关性高,产量与T3的相关性高;真菌分析中,株高同样与CK的相关性高,叶长、叶宽、茎粗与T1的相关性高,产量与T3的相关性高。图9

图9 样品与环境因子RDA

3 讨 论

3.1微生物菌处理土壤是当前农业生产中常用的提高土壤有益微生物种群多样性、复杂性,抑制病原菌繁殖很有效的一项农艺措施[14, 15]。目前,放线菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌已在多种作物上得到很好的应用。放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物,放线菌中的链霉菌分泌的某些物质对丛枝菌根真菌的孢子萌发和菌丝生长有促进作用[26],而丛枝菌根真菌分泌的某些物质又能使有益微生物的活性提高,进而改善土壤微生物群落结构多样性[27, 28]。枯草芽孢杆菌是土壤生态系统中较为常见的根际促生细菌,具有良好的促生、防病及改善土壤微生态群落的作用[29, 30]。邓开英等[31]研究表明,木霉属真菌可以在根区占领根部空间,改变土壤中微生物群落组成和功能多样性,可以防治西瓜土传病害、诱导产生系统抗性、促进生长等作用。研究比较了放线菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉3种微生物菌处理对番茄栽培土壤中的微生物数量的影响,结果显示哈茨木霉处理的土壤中细菌含量最高,放线菌处理的土壤中真菌含量最高,T1、T3的细菌和真菌的比例均大于对照,土壤微生物呈现“细菌化”。细菌和真菌是土壤微生物重要组成部分,能促进土壤有机质的分解和养分的转化[4],其数量和比例变化能够较为敏感地反映土壤环境改变带来的影响、决定土壤功能多样性[32]。施用微生物菌可以使土壤中细菌含量上升,真菌含量降低,土壤微生物由“真菌型”转变为“细菌型”,土壤微生态趋于平衡,控制土传病害[33]。马慧媛等[22]、李凤霞等[34]研究表明微生物菌剂的施用可以增加土壤中细菌和真菌的数量,土壤呈现细菌化状态,与研究结果一致。但是微生物数量指标不能很明确的反映不同微生物菌处理直接的差异。

3.2高通量测序技术能够准确测出微生物的序列,在研究土壤微生物群落结构的复杂性和功能多样性等方面被越来越多地采用[35, 36]。研究结果表明,T1和T3的细菌种类多于CK,T1、T2、T3的真菌种类均少于CK;T2处理的细菌Shannon和Simpson指数均低于CK,T1和T3处理的细菌Shannon和Simpson指数均高于CK,3种微生物菌处理的真菌Shannon和Simpson指数均高于CK,放线菌和哈茨木霉菌处理后可以提高土壤微生物群落多样性。细菌NMDS分析的结果显示,对照、放线菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉4个处理中3个重复的微生物菌群均能聚于一个区域,不同处理细菌间存在差异,相同处理间存在较强的一致性。属水平上的聚类热图分析显示,T1和T3首先聚为一类,然后和CK聚为一类,最后和T2聚为一类,T1和T3微生物菌处理的细菌多样性较为相似。真菌NMDS分析和属水平聚类热图分析结果说明,T1和T3微生物菌处理的真菌多样性较为相似。分析发现细菌中Unspecified_iii1_15、Unspecified_RB41、Unspecified_Gemm_5、Unspecified_Syntrophobacteraceae、Kaistobacter为优势细菌属,除其他(Other)外,CK、T1、T3中Kaistobacter的相对丰度均最高,T2中芽孢杆菌属的相对丰度最高。真菌中Fusarium(镰刀菌属)、Unspecified_Chaetomiaceae(未分类毛壳菌科)、Unspecified_Pezizales、Unspecified_Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Mortierella(被孢霉属)为优势真菌属,镰刀菌属(Fusarium)在4个不同处理中相对丰度最高,镰刀菌是一种植物病原真菌,广泛存在于自然界中,镰刀菌是一种重要的植物病原真菌,可造成番茄、黄瓜、苜蓿等多个器官多个组织的腐烂[37-39]其中,致病性尖孢镰刀菌侵染引起的植物枯萎病是一种土传真菌病害,危害严重[40]。

3.3不同微生物菌处理与环境因子RDA分析结果表明,细菌和真菌的微生物群落变异的解释方差极显著。细菌和真菌中叶宽与微生物群落分布间的相关性均最小,叶长、株高、茎粗和产量与微生物群落分布间的相关性高;叶长和株高间的相关性高,而两者与产量间的相关性低;真菌分析中叶长与叶宽、株高、茎粗三者间的相关性高,与产量间的相关性低。细菌分析中,叶长和株高与CK的相关性最高,茎粗与T1的相关性高,产量与T3的相关性高;真菌分析中,株高同样与CK的相关性高,叶长、叶宽、茎粗与T1的相关性高,产量与T3的相关性高。微生物菌剂通过多种作用机制可促长增产[41],研究结果与其一致。

4 结 论

哈茨木霉处理的土壤中细菌含量最高,放线菌处理的土壤中真菌含量最高,放线菌和哈茨木霉处理的土壤中细菌和真菌的比例均大于对照,土壤微生物呈现“细菌化”。放线菌和哈茨木霉微生物菌处理的细菌和真菌多样性较为相似。镰刀菌属在4个不同处理中相对丰度最高,易引发番茄发生枯萎病,危害严重。放线菌和哈茨木霉对番茄土壤微生物的影响相对较大,叶长、叶宽、茎粗与放线菌的相关性最高,哈茨木霉与产量的相关性最高。