白菜抗根肿病分子标记开发与种质资源鉴定

张立国,郭春贵,常立春,郭新磊,张 涛,武 剑,梁建丽,高 杰,王晓武

(1.新疆农业大学园艺学院/新疆特色园艺作物种质资源与高效生产实验室,乌鲁木齐 830052;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081;3.赣州农业学校,江西赣州 341000)

0 引 言

【研究意义】白菜(BrassicarapaL.)是十字花科芸薹属中重要的作物之一[1],其中大白菜(B.rapassp.pekinensis)是重要的蔬菜作物[2]。十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)所引起的一种土传病害,其病原菌侵染行为只针对十字花科作物[3]。相较于其他防治方法,抗病育种成为当前最为经济有效的防治手段[4]。分子标记辅助育种是通过分子标记对植株基因型直接进行选择,可排除其他因素的干扰。不同类型的抗病材料则可为抗病育种提供多种抗病基因。稳定可靠且能适用于高通量检测的分子标记与具备多种抗病基因的育种材料是抗病育种的先决条件。【前人研究进展】目前在B.rapa基因组中已定位27个抗根肿病基因位点,绝大多数抗病位基因来源于欧洲芜菁(B.rapassp.rapifera)。27个抗病基因位点分布在5条染色体上。其中A03染色体包含14个抗病基因位点,这些抗病基因位点在A03染色体上大致分为2个基因簇,分别位于15.5-16.3Mb与25.2-25.9Mb区域内。15.5-16.3Mb区域内4个抗病位点(BraA.CR.c[5]、Crr3[6]、CRd[7]、PbBa3.2[8])紧密相连;25.2-25.9Mb区域含有7个抗病位点(Rcr2[9]、BraA.CR.a[5]、Rcr1[10]、Rcr4[11]、CRb[12]、CRa[13]、CRq[14])。A08染色体包含8个抗病基因位点(BraA.CR.b[5]、Crr1a[15]、CRs[16]、PbBa8.1[8]、qBrCR38-2[17]、Rcr3[18]、Rcr9[11]、Rcr9wa[18]);A01染色体包含2个抗病基因位点(pbBa1.1[8]、Crr2[15]);A02染色体包含2个抗病基因位点(CRc[19]、Rcr8[11]);A07染色体包含1个抗病基因位点(QBrCR38-1[17]);其中CRa、CRb、CRd、Crr1a抗病基因已被克隆。竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive Allele Specific PCR),简称KASP,是一种针对SNP开发的分子标记检测方法。可对指定位置的SNP与Indel进行检测。KASP标记具有高通量、低成本、分型结果准确等优点。Allen等设计1190对KASP引物在41份普通小麦中进行基因分型,结果1 138对引物具有多态性,标记开发的有效率达到了96%[20]。匡猛等[21]开发了26个KASP标记用于品种纯度的快速检测,为SNP标记技术在棉花品种鉴定及指纹数据库构建等方面的应用奠定基础。【本研究切入点】根肿病抗病基因已被报道,但与之相关的分子标记却无法满足对大规模资源群体进行快速检测的要求。需筛选出携带多种抗根肿病基因的资源材料。【拟解决的关键问题】根据已报道白菜根肿病抗性基因,开发出具备抗根肿病基因特异性的KASP标记。利用KASP标记在白菜资源材料中快速鉴定出携带抗根肿病基因的资源材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

标记测试材料:2019年10底将白菜材料播种至中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区日光温室(E 116°33′,N 39°96′)。播种材料包含12份商用白菜品种,17份抗根肿病资源品种。其余材料由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分子遗传育种实验室提供,包括11份芜菁、11份大白菜、11份小白菜。北京新三号为感病对照品种。其中商用白菜品种与抗根肿病资源品种每份播2粒种子,取样时从不同植株分别取样。

资源群体材料:共使用白菜资源材料862份,2018年种植在北京顺义农场(E 116°88′,N 40°17′),取叶片作为样品保存在-20℃冰箱内。材料均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分子遗传育种实验室提供。表1

表1 862份白菜资源材料种类与数量

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

利用磁珠法提取基因组DNA。使用NanoDrop1000(Thermo,USA)对提取的DNA质量进行检测。将样品DNA浓度稀释至10～20 ng/μL,-20℃冰箱内保存备用。

1.2.2 KASP标记开发

已报道的抗根肿病基因CRa、CRb、CRd、Crr1a的DNA序列与感病白菜参考基因组Chiffu v3.0进行比对,获得SNP位点。KASP标记引物设计利用DNAMAN与Primer3软件。

KASP反应在384微孔板中进行。DNA、引物混合物、KASP master mix均由Matrix Arrayer(瀚辰光翼)加至384微孔板内。反应体系包括DNA模板1 μL,浓度为10～20 ng/μL;KASP master mix(1x)0.11 μL;引物混合物(10 μmol/L)0.89 μL,两条正向特异竞争性引物与一条反向通用引物比例为1∶1∶2.5。

KASP标记的PCR反应共需4个阶段,第1阶段95℃变性持续10 min;第2阶段95℃持续变性20s,61℃退火45s,共10个循环(每次循环降低0.6℃);第3阶段95℃变性20s,55℃退火45s,共37个循环,该过程由Matrix Cycler(瀚辰光翼)水浴PCR仪完成。最终利用Matrix Scanner(瀚辰光翼)读取样品荧光信号值,根据不同的荧光信号来判断样品基因型。

1.3 数据处理

利用Excel 2019对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 抗根肿病KASP标记筛选结果

研究表明,四个不同抗病基因中的SNP位点设计出42个KASP标记,其中6个KASP标记在测试群体中具有较好的多态性且重复性良好。表2,表3,图1,图2

注:蓝色为已定位QTL抗根肿病位点;红色为已定位显性抗根肿病位点;绿色为开发的KASP标记;黑色为修饰位点

图2 KASP标记分型结果

表2 已克隆抗根肿病基因KASP引物序列

表3 引物一致率

2.2 种质资源内抗根肿病基因分布

研究表明,862份材料中包含多种白菜类作物,利用6个KASP标记从中鉴定出含有抗病基因型材料105份,其中标记CRa-3.1检测出61份为抗病基因型(含有CRa);标记CRBrG3-8检测出44份为抗病基因型(含有CRb);标记Crr1a-10检测出7份为纯合抗病基因型(含有Crr1a);标记CRd-2G检测出53份为抗病基因型;标记CRd-3检测出26份为抗病基因型;标记CRd-4检测出15份为抗病基因型。CRd-2G、CRd-3、CRd-4都来自CRd基因,当材料中3个CRd标记均为抗病基因型时,材料含有CRd基因,此类材料10份。表4,图3

表4 862份白菜资源材料中抗感基因型数量

芜菁与油用白菜是根肿病抗病基因的主要来源,携带4种抗病基因的材料中,该类型材料在CRb中占比最低,为59.09%;10份携带CRd抗病基因的材料均为芜菁与油用白菜类型,占比100%。105份抗病基因型材料中,74份为芜菁与油用白菜类型,占比70.48%。分布最为广泛的抗病基因为CRa,占所有抗病材料的58.09%。

单份材料中可同时携带多个抗病基因。16份材料同时携带2个或2个以上的抗病基因,其中包含12份芜菁、3份油用白菜与1份Grelos。材料中抗病基因分布为1份材料(SY18Q0717)同时含有CRa、CRb、CRd3个抗病基因;1份材料(SY18Q0980)同时含有CRd、Crr1a两个抗病基因;4份材料(SY18Q0769、SY18Q0699、SY18Q0664、SY18Q0994)同时含有CRa、CRd2个抗病基因;10份材料(SY18Q0869、SY18Q0821、SY18Q0848、SY18Q0779、SY18Q0972、SY18Q0984、SY18Q0948、SY18Q0985、SY18Q0668、SY18Q0913)同时含有CRa、CRb2个抗病基因。6份材料只含有Crr1a抗病基因;46份材料只含有CRa抗病基因;33份材料只含有CRb抗病基因;4份材料只含有CRd抗病基因。在自然群体中,大多数抗根肿病基因型材料中只含有单个抗病基因。表5,图4

图4 资源材料中抗病基因分布

表5 多基因抗病材料类型与抗病基因分布

3 讨 论

3.14个显性抗根肿病基因(CRd、CRb、CRa、Crr1a)[7,12-13,15]已被成功克隆并验证功能,根肿病作为危害十字花科作物的主要病害,十字花科作物生产均受其影响[22]。早期对于抗根肿病基因的相关研究认为抗根肿病这一性状是由单显性基因控制[23]。更多抗根肿病基因在不同材料中被定位,不同根肿病生理小种与抗病基因之间存在对应关系。根肿病生理小种不断变异分化,其致病性各不相同,导致单基因抗根肿病材料的抗病能力逐渐减弱、退化甚至丧失[24]。在同一植株中聚集多个抗病基因的聚合育种成为未来抗根肿病育种的主要方向[25]。

3.2研究对测试材料德高CR117的标记检测结果表明其不含CRa、CRb、CRd、Crr1a基因,与前人研究一致[26-27];6个标记检测感病对照(北京新3号)均为易感基因型;CRa抗病基因来自欧洲芜菁(ECD02)[13],测试材料中两份ECD02均携带CRa纯合抗病基因。研究开发的KASP标记能对指定抗根肿病基因进行特异性鉴定且分型结果准确。

3.3研究共鉴定出105份含有抗根肿病基因的资源材料,芜菁与油用白菜是主要类型;Grelos与意大利菜心同属于欧洲材料类型,也可能含有抗根肿病基因,16份携带多抗病基因材料由12份芜菁、3份油用白菜与1份Grelos组成,该结果与绝大部分根肿病抗病基因来源于欧洲芜菁这一观点[5-6,8,11,13,15-19]相符合。在少量大白菜材料中鉴定出CRa或CRb抗病基因,可能是由于在现代育种中,通过人工转育将芜菁抗根肿病基因导入大白菜内所造成的。105份携带抗病基因的材料可作为后续抗病育种的亲本,为大白菜抗根肿病育种提供丰富的材料与抗病基因来源。

3.4研究中用于KASP标记开发的DNA序列均来自前人已发表数据,利用其成功开发出可鉴定抗根肿病基因的KASP标记。ECD欧洲根肿病生理小种鉴定系统(European Clubroot Differential Series)是世界上通用的生理小种鉴别系统之一[28],其中鉴别材料ECD01～ECD04均为芜菁且各自携带有不同的抗根肿病基因,其中ECD04材料全基因组测序数据已于2021年发表[29],该材料对多种根肿病生理小种具备抗性;包含多个不同的抗根肿病基因[8,26]。在后续研究中,可以此数据为基础,利用其抗根肿病基因内的变异位点设计分子标记。

4 结 论

开发出6个可在自然群体材料中准确鉴定抗根肿病基因的特异性KASP标记。862份白菜资源材料中,105份携带有抗根肿病基因,其中芜菁与油用白菜为主要类型,共计74份,占比70.48%。CRa抗病基因分布数量最多,共计61份材料携带有CRa抗病基因,占所有抗病材料的58.09%。抗根肿病基因在自然材料体内多以单个基因形式存在,89份材料只携带单个抗根肿病基因,体内同时聚集2个或2个以上抗根肿病基因的材料共计16份。