重金属镉胁迫对甜菜夜蛾体内保幼激素和蜕皮激素滴度的影响

吴梦露,孙清明,吴娇娇,王 凯,杨 旸,杨益众,苏宏华

(1.扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州 225009; 2.广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室,广州 510640)

0 引 言

【研究意义】昆虫通常以取食和呼吸等方式吸收环境中的镉,并不断积累,对自身的生长发育和生殖等产生影响,如不同虫态存活率的改变、发育历期的缩短/延长、产卵量的刺激/抑制、卵孵化率的提高/降低等[1]。具有类雌激素作用,可扰乱哺乳动物的内分泌系统,从而干扰雌激素和孕激素的分泌,使卵泡的发育受到影响,而且对哺乳动物的生殖细胞具有直接的毒害作用,甚至会影响基因的表达[2-3]。保幼激素(JH)和蜕皮激素(MH)在昆虫生长发育和繁殖中发挥至关重要的作用,共同调控昆虫的变态发育[4]。在昆虫的幼虫期,JH能够阻止由MH引起的变态发育过程,从而使幼虫经历蜕皮后依旧维持幼虫的形态;在幼虫的最后一次蜕皮前,JH浓度会逐渐降低甚至消失,导致昆虫能够在MH的作用下完成变态发育[5]。【前人研究进展】昆虫体内的JH和MH滴度受多种外源因素的影响,如温度、化学药剂、天敌寄生、紫外线照射等。棉铃虫HelicoverpaarmigeraHübner在经过长时间的紫外线照射后,体内的JH滴度明显降低[6];长红猎蝽Rhodniusprolixus在低温时体内合成JH较多,而在高温时合成MH较多[7];烟粉虱BemisiatabaciGennadius在被双斑恩蚜小蜂EncarsiiabimaculateHeraty et Polaszek寄生后,其高龄若虫体内的JH和MH含量能够维持在低龄若虫的水平[8];小菜蛾PlutellaxylostellaLinnaeus 3龄初孵幼虫经喜树碱处理后,体内的JH滴度升高,MH滴度下降[9]。【本研究切入点】保幼激素和蜕皮激素在昆虫生长发育和繁殖中发挥至关重要的作用。关于重金属镉对昆虫两大重要激素-保幼激素和蜕皮激素滴度的影响目前未见报道。而有关镉胁迫对昆虫体内保幼激素和蜕皮激素滴度影响的研究还少见报道。甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner是一种多食性农业害虫[10],主要危害蔬菜、棉花、花生、烟草、玉米、大豆等35科108属138种作物,尤以蔬菜受害最重[11]。甜菜夜蛾具有很强的迁飞能力,是目前报道的鳞翅目夜蛾科昆虫中迁飞距离最远的昆虫。若使用化学药剂,会使得甜菜夜蛾对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、苯甲酰胺类及多杀菌素等多种不同作用机制的农药产生不同程度的抗性[12]。【拟解决的关键问题】采用镉含量分别为0、0.2、3.2和51.2 mg/kg的人工饲料饲喂甜菜夜蛾初孵幼虫直至化蛹,研究不同浓度重金属镉对甜菜夜蛾体内保幼激素和蜕皮激素的滴度影响,为重金属污染对昆虫生长发育及种群发展动态的影响提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

甜菜夜蛾蛹由中国农业科学院植物保护研究所提供,在LED光照恒温培养箱中用人工饲料饲养10代后,选择健康的虫源作为材料。将甜菜夜蛾成虫产的卵放置于一次性纸碗(上口径13 cm,底直径10 cm,高度7.5 cm)中,待卵孵化后,加入人工饲料,每天更换饲料,待养至3龄后分盒饲养,每盒放置15头,饲养温度设定为(26±1)℃,相对湿度为70%±10%,光周期L//D=14 h//10 h。

1.2 方 法

1.2.1 人工饲料的配制

人工饲料的配方由李腾武等[13]的配制方法改良后得到。称取100 g大豆粉、100 g玉米粉、50 g麦麸、80 g酵母粉和5 g干酪素,放置于干净的塑料盒中,混合均匀后放入烘箱中,以120℃烘2 h;烘好后取出,称取10 g白砂糖倒入其中,再向其中倒入450 mL开水,搅拌均匀备用。将450 mL清水煮开,加入25 g琼脂,搅拌至琼脂完全融化,再加入5 g山梨酸、3 g柠檬酸、5 g抗坏血酸、2 g复合维生素、1 g胆固醇、1 g氯化胆碱和0.5 g红霉素,搅拌均匀后将之前配好的各饲料成分倒入锅中充分搅拌。将配好的饲料迅速取出倒入已消毒的饲料盒中,冷却至室温后再放入冰箱保存,以防止腐败变质。

1.2.2 含重金属镉的人工饲料配制

步骤基本同上,加入清水时要减去加入的重金属溶液的体积。在加入5 g山梨酸、3 g柠檬酸、5 g抗坏血酸、2 g复合维生素、1 g胆固醇、1 g氯化胆碱和0.5 g红霉素后搅拌,待搅拌均匀后用移液枪吸取一定量的氯化镉水溶液(国药集团化学试剂有限公司)加入其中并充分搅拌,配制成镉浓度分别为0.2、3.2和51.2 mg/kg的重金属镉人工饲料。

1.2.3 甜菜夜蛾体内保幼激素和蜕皮激素滴度的测定

1.2.3.1 样本收集

甜菜夜蛾卵孵化后,分别用镉含量为0、0.2、3.2和51.2 mg/kg的人工饲料饲喂,每日观察甜菜夜蛾的生长发育进度。收集每个处理的3龄末和5龄末幼虫、羽化后的1日龄雌成虫和雄成虫各30头(3次重复,每次重复10头),放入液氮中,快速冷冻样本,置于-20℃冰箱中备用。

1.2.3.2 甜菜夜蛾保幼激素和蜕皮激素的测定方法

向盛有样本的离心管中加入试验样本重量9倍的PBS(pH7.4),用研磨仪将样本充分研磨,3 000 r/min离心10 min。取上清液保存于新的离心管中。分别取10 μL上清液用于测定保幼激素和蜕皮激素,其余放入-20℃冰箱中冷冻保存以备它用。

甜菜夜蛾体内保幼激素和蜕皮激素含量的测定分别使用昆虫保幼激素酶联免疫分析试剂盒(YX-110800I)和昆虫蜕皮激素酶联免疫分析试剂盒(YX-050304I)(桥杜生物科技有限公司,上海),试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELASA)。往预先包被昆虫激素捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温浴并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的昆虫保幼激素(JH)呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD 值),以此计算样品JH及MH浓度即滴度的大小。操作步骤参见试剂盒使用说明。

1.3 数据处理

使用Excel软件进行原始数据的统计处理,试验数据用平均值±标准误表示。利用SPSS数据统计软件对试验数据进行单因素方差分析,利用Duncan氏法进行多重比较,分析CK与各浓度镉处理组各龄期保幼激素和蜕皮激素滴度之间的差异性,显著水平设置为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 保幼激素和蜕皮激素的标准曲线

研究表明,保幼激素和蜕皮激素的标准曲线均呈线性关系,线性回归方程分别为Y=0.009 7X+0.074 7和Y=0.260 3X+0.086 9,相关系数R2均达到0.999 1。2条标准曲线均可用于甜菜夜蛾体内保幼激素和蜕皮激素滴度的定量分析。

2.2 重金属镉处理对甜菜夜蛾体内保幼激素滴度的影响

研究表明,0.2 mg/kg镉处理组中3龄幼虫体内的保幼激素滴度显著高于对照,比对照组上升18.37%;3.2和51.2 mg/kg镉处理组中3龄幼虫体内的保幼激素滴度与对照组相比无显著差异。0.2 mg/kg镉处理组中5龄幼虫体内的保幼激素滴度与对照组相比无显著差异;3.2和51.2 mg/kg镉处理组中5龄幼虫体内的保幼激素滴度显著低于对照,分别下降18.85%、24.66%。0.2、3.2和51.2 mg/kg镉处理组中雌成虫体内的保幼激素滴度显著高于对照,与对照组相比分别提高了215.71%、205.55%、249.35%。0.2、3.2和51.2 mg/kg镉处理组中雄成虫体内的保幼激素滴度显著高于对照组,分别提高446.65%、442.90%以及453.08%。0.2 mg/kg镉处理组中3龄5龄幼虫体内的保幼激素滴度显著高于3.2和51.2 mg/kg镉处理组;而雌雄成虫中0.2、3.2、51.2 mg/kg镉处理后保幼激素滴度无显著差异。表1

表1 不同镉浓度胁迫下不同发育阶段甜菜夜蛾体内保幼激素滴度变化

2.3 重金属镉处理对甜菜夜蛾体内蜕皮激素滴度的影响

研究表明,51.2 mg/kg镉处理组中3龄幼虫体内的蜕皮激素滴度显著低于对照,下降了48.14%;0.2、3.2 mg/kg镉处理组中3龄幼虫体内的蜕皮激素滴度与对照组相比无显著差异。0.2 mg/kg镉处理组中5龄幼虫体内的蜕皮激素滴度显著高于对照,升高了140.38%;3.2、51.2 mg/kg镉处理组中5龄幼虫体内的蜕皮激素滴度与对照组相比无显著差异。0.2、3.2、51.2 mg/kg镉处理组中雌成虫体内的蜕皮激素滴度都显著低于对照,与对照组相比分别下降了19.13%、22.38%和16.32%。0.2、51.2 mg/kg镉处理组中雄成虫体内蜕皮激素滴度与对照组相比无显著差异;3.2 mg/kg镉处理组中雄成虫体内的蜕皮激素滴度显著低于对照,下降了29.20%。另外,51.2 mg/kg镉处理组中3龄、5龄幼虫体内蜕皮激素滴度显著低于3.2 mg/kg镉处理组,51.2 mg/kg镉处理组雄成虫体内的蜕皮激素滴度显著高于3.2 mg/kg镉处理组。表2

表2 不同镉浓度胁迫下不同发育阶段甜菜夜蛾体内蜕皮激素滴度变化

3 讨 论

3.1镉对昆虫繁殖力(产卵量、卵孵化率等)具有显著作用[14-16],曹红妹[17]将含镉的人工饲料饲养亚洲玉米螟幼虫,雌蛾的产卵量和卵孵化率明显下降。胡蒙蒙[18]用51.2 mg/kg浓度镉处理甜菜夜蛾,发现单雌产卵量较对照降低了19.7%。镉可导致昆虫繁殖力的下降,主要为产卵量减少、卵孵化率降低、卵巢成熟延迟及卵发育历期延长等[1],而镉对昆虫繁殖力的影响机制目前还没有相对系统的研究。

3.2目前,镉对昆虫配子发生的影响机制研究大多以卵黄原蛋白(Vg)为起点,因为卵黄原蛋白合成是卵黄发生的基础,是卵子成熟与胚胎发育

的关键[19],而卵黄发生是昆虫生殖调控的核心[20],直接影响昆虫的繁殖力。镉对卵黄原蛋白的表达有显著影响,采用50～400 mg/L镉处理乳草长蝽成虫,导致其卵巢中的卵黄原蛋白多肽水平降低[21]。

3.3保幼激素可调控卵黄原蛋白(Vg)合成、卵母细胞的成熟以及卵母细胞对卵黄原的吸收[22-23]。在东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis雌成虫的研究中发现,利用RNAi技术干扰JH受体基因Met,可以减少Vg的表达量,同时阻止卵巢发育[24]。

3.4蜕皮激素(MH)是由昆虫的前胸腺合成并分泌的一种类固醇激素,对调节昆虫的生长发育、代谢和生殖等具有重要作用[25]。杨欣[26]研究不同浓度的MH对家蚕蜕皮影响时发现,注射低浓度蜕皮激素减少了平均蜕皮时间,死亡率降低了20%。在昆虫体内,蜕皮激素主要以20E形态存在,庞海玉[27]研究发现,用0.1和0.5 mg/L的20E处理异色瓢虫Harmoniaaxyridis后能缩短幼虫的发育历期。先前的研究结果显示,低浓度镉(0.2、3.2 mg/kg)处理后甜菜夜蛾幼虫的发育历期缩短,高浓度镉(51.2 mg/kg)处理后幼虫的发育历期显著延长[18]。不同浓度镉处理甜菜夜蛾后,雌成虫体内保幼激素滴度均显著提高,而高浓度保幼激素及其类似物对昆虫繁殖力具有抑制作用[29-30],JH和MH是昆虫生长发育和繁殖的重要调控因子,重金属镉胁迫通过改变昆虫体内JH和MH的滴度进而对昆虫生长发育和生殖产生影响。

4 结 论

4.1镉处理后,甜菜夜蛾的产卵量和卵孵化率将显著下降。

4.2低浓度镉(0.2、3.2 mg/kg)处理后可使甜菜夜蛾幼虫蜕皮激素滴度显著升高;高浓度镉(51.2 mg/kg)处理后可使甜菜夜蛾幼虫蜕皮激素滴度显著降低。在不同镉浓度处理后,甜菜夜蛾体内保幼激素、蜕皮激素滴度将发生变化,进而对其生长发育、生殖调控发挥作用。