赛里木酸奶中乳酸菌的分离鉴定及特性分析

何 齐,冯 倩,李 雪,易鸳鸯,顾美英,朱 静,孙 建,张志东,

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052;2. 新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】赛里木镇位于新疆阿克苏地区拜城县,赛里木酸奶质地粘稠,拉出的长丝能达到1 m左右,又被称作赛里木拉丝酸奶[1]。乳酸菌在胃肠道中繁衍增殖, 能够维持肠道菌群动态平衡、增强机体免疫力[2]。赛里木酸奶虽然具有良好的风味特征,但关于其中微生物组成的研究还不深入,传统的发酵方式该种酸奶的微生物组成复杂,组分及其相互作用也不明确。分离、保藏赛里木酸奶中的乳酸菌对于开发和利用优良菌种资源有着重要意义。【前人研究进展】玛依诺·木图拉[3]从赛里木酸奶中筛选得到得到2株产粘乳酸菌,分别为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilic)和瑞士乳酸菌(Lactobacillushelveticus);高冬腊[4]在赛里木酸奶中分离得到1株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus),均具有较好的益生特性。【本研究切入点】有关赛里木酸奶中乳酸菌的分离鉴定及特性分析文献较少,近些年来,对赛里木酸奶的相关研究在逐渐增加,但赛里木酸奶中微生物资源丰富,需进一步挖掘利用。【拟解决的关键问题】以采集到的12种赛里木酸奶为研究对象,筛选鉴定赛里木酸奶中分离得到的乳酸菌,检测生理生化特性。筛选益生效果好、食用安全的乳酸菌资源,有效扩大特色乳酸菌资源库和保护利用相关益生资源。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

赛里木酸奶样品:分别采自新疆阿克苏地区拜城县赛里木镇周边。

供试菌株:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、青霉菌(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)菌株,均由新疆微生物资源保藏管理中心(Microbiological Culture Collection Center of Xinjiang,MCCCX)提供。

1.1.2 试 剂

无水乙醇、冰乙酸、溴酚蓝、吐温-80、戈卢氏碘液、刚果红,均为分析纯,由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供。

吲哚试剂:取 0.1 g 对二甲氨基苯甲醛,用 5 mL 95%乙醇溶解,然后再缓慢加入 2 mL 浓盐酸。

α-萘胺试剂:1 g α-萘胺溶于 20 mL 蒸馏水和 150 mL 200 g/L 的乙酸溶液中。

对氨基苯磺酸试剂:0.5 g 对氨基苯磺酸溶于 150 mL 200 g/L 的乙酸溶液中。

抗生素滤纸片:青霉素 10 IU/片、红霉素 15 μg/片、四环素 30 μg/片、链霉素 10 μg/片、庆大霉素 10 μg/片、卡那霉素 30 μg/片、诺氟沙星 10 μg/片、氨苄西林 10 μg/片、利福平 5 μg/片、万古霉素 30 μg/片,购自北京天坛生物制品股份有限公司。

1.1.3 主要培养基

MRS 培养基、哥伦比亚血琼脂培养基和 LB 液体培养基,由青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供。

生物胺检测培养基:牛肉膏 5.0 g,胰蛋白胨 5.0 g,酵母粉 5.0 g,葡萄糖 0.5 g,柠檬酸铵 2.0 g,NaCl 2.5 g,K2HPO4·7H2O 2.0 g,吐温-80 1 mL,MgSO40.2 g,CaCO30.1 g,FeSO40.04 g,MnSO40.05 g,VB10.01 g,5-磷酸吡哆醛 0.05 g,溴甲酚紫 0.06 g,琼脂 20 g,蒸馏水 1 000 mL,pH 值 5.8～6.0。

改良氨基脱羧酶检测培养基:分别在生物胺检测培养基中加入 10 g/L 的对应前体氨基酸(精氨酸、酪氨酸、尸氨酸、色氨酸、组氨酸)。

蛋白胨水培养基:蛋白胨 20 g,氯化钠 5 g,蒸馏水 1 000 mL,pH 7.4～7.6。

1.1.4 仪器与设备

超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);自动高压灭菌锅(日本 HIRAYAMA 公司);TS 恒温振荡器(德国耶拿分析仪器股份公司);PCR仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司);生化培养箱(上海福玛实验设备有限公司);立式冷藏柜(海尔 HAIER 公司);电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集

赛里木酸奶样品采自新疆阿克苏地区拜城县,经灭菌的 50 mL 离心管分装,放入车载低温冰箱保存,采样结束后分别放入4℃和-80℃冰箱保存,备用。表1

表1 样品及来源

1.2.2 菌株分离筛选

在无菌条件下吸1 mL 样品于9 mL的无菌生理盐水中, 振荡混匀, 采用梯度稀释法,将稀释液在含有1% CaCO3的MRS固体培养基上涂布,37℃倒置培养48 h。挑取有溶钙圈的细菌单菌落,进一步划线纯化后,转接至MRS斜面培养基上,37℃培养48 h, 4℃下保存备用。

该船船型较小，为了提高轴系安装的工作效率，选用直线校中方法，按连接法兰上规定的偏中值进行校中。采用此法安装和校中轴系时，通常按照从后往前的顺序，先按轴系中心线装好尾轴，然后以尾轴为基准，从船尾向船头方向一段一段地调整各段轴的具体位置，并按照规范要求调节每一对连接法兰上的偏移值和曲折值，最后，以推力轴的前法兰作为基准对主机进行定位。具体步骤如下：

1.2.3 菌株分子鉴定

挑取少量新鲜的乳酸菌单菌落,以菌株DNA为模板,使用16S rRNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增,扩增产物在进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测之后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

将测序完成的DNA序列利用SeqMan (DNAStar 6.0)软件进行序列拼接,将得到的菌株的16S rRNA基因序列在EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中比对分析,使用MEGA 7.0进行ClustalX多重比对,构建Neighbor-Joining系统发育树,确定菌株分类地位。

1.2.4 菌株的生长特性

以MRS液体培养基为基础培养基进行菌株的生长温度、耐盐、耐酸特性检验,在含0.5%猪胆盐的乳糖胆盐培养基上进行胆盐耐受性检验,牛奶胨化实验参考《常见细菌系统鉴定手册》[5]进行。

1.2.5 菌株的功能性酶活

将各乳酸菌株点接接种至相应功能酶筛选培养基上,30℃培养3～5 d,测定菌株的蛋白酶、果胶酶、酯化酶、淀粉酶和纤维素酶活性,其中,蛋白酶、果胶酶和酯化酶筛选直接观察透明圈;淀粉酶筛选用0.1%的碘液染色后观察透明圈;纤维素酶筛选用0.1%的刚果红染色后观察透明圈[6]。

1.2.6 菌株的抑菌活性

将指示菌株大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌,接种于LB液体培养基中,30℃、120 ×g条件下振荡培养16 h。取100 μL发酵菌液,均匀涂布于MRS固体培养基。全部菌液平板吸收后,在设定区域的中央接种菌株,30℃培养48 h,确定出其产抑菌圈性能,充分的冲洗青霉菌、黑曲霉,根据要求将孢子悬液涂布后点接待测菌株,30℃环境条件下充分培养48 h后观察,判断出其产抑菌圈。

1.2.7 溶血性测定

将乳酸菌株接种到血琼脂平板上,在37℃下培养48 h,其附近产生透明的溶血环,对应为β-溶血;观察出现一定尺度的草绿色环,对应为α-溶血;未出现变化的,对应为γ-溶血。以金黄色葡萄球菌作为阳性对照。

1.2.8 有害代谢物质检测

①生物胺的测定[7]:将活化后的菌株继续进行接种培养,分别在改良氨基脱羧酶、无前体氨基酸的平板接种,37℃下培养48 h,观察其颜色,在发现紫色情况下判断为阳性,否则为阴性。②吲哚试验参照王梦娇[8]试验。③硝基还原酶活性检测参照孟丹实验[9]进行。

1.2.9 菌株的自聚合能力测定

将乳酸菌接种至MRS液体培养基,37℃,120 ×g条件下培养48 h,将发酵后菌液在3 000 ×g、4℃条件下离心10 min,弃去上清液,保留菌体,重悬于无菌生理盐水中,调节600 nm下的OD值至0.5,记为A0h)。振荡混匀30 s,在酶标板中加入400 μL菌悬液,37℃条件下静置2 h。静置完成后,吸取200 μL上清液,测定其在,记为A2h,乳酸菌自凝率测定如下所示,取3次重复试验的平均值[10]。

自凝率(%)=(1-A2h/A0h)×100.

1.3 数据处理

每个样品测定 3 次取平均值,采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 酸奶中分离乳酸菌及其生理生化特性鉴定

研究表明,从赛里木酸奶中分离出4种乳酸菌菌分属于Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4个属下的4个种。图1

图1 赛里木酸奶中乳酸菌的系统进化树

2.2 菌株的生长特性

研究表明,其中4株乳酸菌在45℃正常生长,没有异常;所有菌株在生长过程中对5%的NaCl都有良好的耐受性,其中菌株S5-1能耐受7%的NaCl;pH 3.0时不生长,适当的增加酸碱度在pH为4时,开始微弱的生长。在含0.5%猪胆盐培养基上4株试验菌株的生长都没有受到影响。4株试验菌株的胨化能力均较好,生长过程中并不析出乳清;菌株H4-2发酵牛奶可产生浓郁香气,质地柔和细腻。表2

表2 菌株的生长情况

2.3 菌株的自聚合能力测定

研究表明,4种菌株均表现出良好的自聚合能力,自凝率最高的为H4-2,达到83.46%,最低为S5-1,达到67.1%。 图2

图2 菌株的自凝率变化

2.4 菌株的功能酶活性

研究表明,4株菌均具有蛋白酶活性,但不具有其他功能酶活性。表3

2.5 菌株的抑菌活性

研究表明,4株菌均对大肠埃希菌有抑制作用,其中D1-3与H4-2的抑菌活性较强;4株菌对金黄色葡萄球菌有抑制作用,其中H4-2的抑菌活性较强;3株菌对枯草芽孢杆菌有抑制作用;仅有H4-2对白色念珠菌有抑制作用,所有菌均不抑制青霉菌和黑曲霉。表4

表4 菌株的抑菌活性

2.6 菌株的生物安全性

研究表明,4株菌的生物安全性都达到较高水平,其中H5-4菌株在含L-色氨酸的平板上阳性,由此可判断出其产胺性能强,可转换前体形成色胺,其他的菌株都为阴性。在硝基还原酶检测结果表明,除H5-4菌株外都不产生硝基还原酶。所有菌株在吲哚实验中均为阴性结果,并且均不具有溶血性。表5

表5 菌株的有害代谢物质检测

3 讨 论

3.1传统的发酵乳制品的品质和与所处地理条件之间存在密切联系,是因为当地的气候、环境等因素对乳制品中微生物的种群特征会产生明显影响[11]。在食品风味物质形成过程中,微生物群落的作用很重要,同时也和食物的储藏密切相关[12]。研究传统发酵乳制品的微生物菌群结构,在分析发酵进程方面也有较高的应用价值,同时也可为产地溯源系统的建立提供依据和支持[13]。

3.2赛里木酸奶独特风味的形成与其复杂的微生物组成有着直接的关系,高冬腊[4]在赛里木酸奶中利用高通量测序发现,酸奶中的优势菌门为厚壁菌门,优势细菌属为乳杆菌属和链球菌属。王子涵[14]利用高通量测序技术在赛里木酸奶中得到的结果基本相同,酸奶中链球菌属为优势菌属,其次为乳杆菌属。研究在阿克苏地区赛里木镇周边收集到12份赛里木酸奶样品,分离筛选得到36株乳酸菌,经16S rRNA基因序列分析鉴定为Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4个属下的4个种,分别为S5-1(Eremococcuscoleocola)、H4-2(Lentilactobacilluskefiri)、H5-4(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)及D1-3(Streptococcusthermophilus)。

3.3乳酸菌作为典型的益生菌,具有多种益生特性,但乳酸菌需要经过胃肠道转运,粘附在宿主肠道的上皮细胞表面实现肠道定植,是乳酸菌能够更好发挥其益生功能的关键。由于胃肠道中存在的胃酸及胆汁,乳酸菌必须具有一定的耐酸和耐胆盐能力[15, 16]。研究中4株乳酸菌在生长过程中对5%的NaCl都有良好的耐受性,其中菌株S5-1能耐受7%的NaCl,并均具有一定的耐酸能力。自聚合能力也是评价乳酸菌粘附性能的重要因素之一,也是益生菌粘附于肠道,作为生物屏障发挥功能的基础[10],4种菌株均表现出良好的自聚合能力,自凝率最高的为H4-2,达到83.46%,最低为S5-1,达到67.1%。

3.4乳酸菌的抗菌能力,是其众多益生功能中的一个重要特性,能够避免胃肠道感染的出现[17]。王融等[18]在研究鱼类肠道乳酸菌时发现,肠道乳酸菌在生长过程中会分泌出胞外物质,这种物质可以将病原菌与胃肠道黏膜隔绝开来,此外肠道乳酸菌还会与病原菌竞争营养物质,同时分泌出具有抗菌活性的代谢产物,进而达到抑制病原菌生长繁殖的效果。蔡静静等[19]在新疆伊犁地区乳制品中分离得到7株对大肠埃希氏菌具有较好抑制性的乳酸菌。研究中4株乳酸菌均对大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中H4-2的抑菌活性较强;3株菌对枯草芽孢杆菌有抑制作用;仅有H4-2对白色念珠菌有抑制作用。不同乳酸菌之间抑菌范围及抑菌效果均存在较大差异,可能是由于不同乳酸菌所产生的的代谢产物不同,仍需进一步研究。

3.5生物胺是一种含氮化合物,具有一定的生物活性[20],生物体内普遍存在着微量的生物胺,并且承担着重要的生理功能[21-23],但生物胺摄入过量会引起多种不良反应[24-26]。

4 结 论

在12种赛里木酸奶样品中筛选得到4种乳酸菌,分属于Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4个属下的4个种,试验菌株可耐受0.5%胆盐,0.5%NaCl,且具有较好耐高温、牛奶胨化和抑制细菌等特性,并展现出良好的自聚合能力。4株乳酸菌均不溶血,且吲哚检测试验均呈阴性,除H5-4外均不产生硝基还原酶及生物胺。