外源褪黑素对镉胁迫烟草幼苗的缓解效应

吕怡颖，郑元仙，王继明，胡骞予，蔡宪杰，陈小龙，余 磊，黄飞燕*，韩天华

（1.昆明学院，云南省都市特色农业工程技术研究中心，昆明 650214；2.云南省烟草公司临沧市公司，云南 临沧 677000；3.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082；4.河南中烟工业有限责任公司，郑州 450000；5.云南省烟草公司丽江市公司，云南 丽江 674100）

镉（Cd）是生物体非必需且毒性很强的一种重金属元素[1]。随着工业生产废物排放，农药化肥滥用，导致农田土壤Cd 含量不断增加。同时，Cd 因其自身攻击性强、迁移性快等特性极易进入植物体对植物细胞造成氧化损伤，进而影响植株生长发育[2-3]。烟草作为全球广泛种植的非粮食经济作物，是一种易富集Cd 的植物[4]。Cd 通过根系吸收进入烟草体内，随着时间累积大部分Cd 富集在烟叶上，破坏烟叶中烟碱、氮和一些碳水化合物的平衡，严重降低烟叶口感和产量[5-6]。且长期的Cd 摄入会对人体健康带来巨大威胁[7]。因此，减少烟叶Cd 积累是未来烟草研究的重要方向。

褪黑素（MT），一种小分子吲哚胺类化合物，又称松果体素。最初被认为只存在于人和动物体内，后经研究发现在一些植物里也存在且具有广泛的生物学功能。它可作为植物生长调节剂促进细胞膨大、根发育，参与开花调控等[8]，还能作为抗氧化剂增强植物对干旱、盐、低温、重金属等胁迫的抗性[9-12]。现有研究表明，褪黑素可通过提高POD、SOD、CAT 等抗氧化酶活性来减少过氧化氢、MDA的含量，减轻低温胁迫给植物马铃薯幼苗造成的伤害，进而提高马铃薯幼苗抗低温胁迫的能力[13]；可增大根冠比，提高根系对水分及养分的吸收能力，缓解干旱胁迫对苦荞幼苗的伤害[14]；可增强脱氢抗坏血酸还原酶、抗坏血酸过氧化酶及谷胱甘肽还原酶活性，提高可溶性蛋白、可溶性糖含量，进而提高小黑麦的渗透调节能力和抗氧化能力，以促进盐碱胁迫下小黑麦种子的萌发和幼苗生长[15]。然而不同浓度褪黑素缓解胁迫能力不尽相同。蒋希瑶等[16]发现在60 mmol/L 碱胁迫下，喷施200 μmol/L MT处理对植物生长发育形态指标缓解效果最为显著，而刘跃威等[17]发现100 μmol/L MT 缓解宝岛蕉幼苗盐毒害能力最强。本研究旨在探讨Cd 胁迫对烟草生长发育的影响及叶面喷施不同浓度褪黑素对烟草云烟100 中Cd 胁迫的缓解效应，以期为烟草抗逆性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

试验于2022 年3 月在昆明学院云南省都市特色农业工程技术研究中心人工气候培养箱内进行，人工气候培养箱条件为光强6000 lx，28 ℃/24 ℃（12 h昼/12 h 夜），相对湿度75%，照光12 h/d。

1.2 试验材料

供试烟草品种为云烟100，由昆明学院云南省都市特色农业工程技术研究中心提供。褪黑素购于上海麦克林生化科技有限公司。氯化镉购于上海金山亭新化工试剂厂。

1.3 试验设计

挑选经消毒浸种的饱满烟草种子，放置育苗盘中发芽，当烟苗长至2 片真叶时，洗净根部后移入盛有1/2 霍格兰氏（Hoagland’s）营养液的植物水培盒（长127 mm，宽87 mm，高114 mm；孔径6.3 mm）中，每盆定植6 株，置于人工培养箱培养缓苗3 d后，选取长势大致相同的烟草幼苗进行试验处理。

1.3.1 不同浓度Cd 胁迫对烟草幼苗生长发育的影响 试验采用水培法，设置5 个Cd 处理浓度：0（CK）、50、100、150、200 µmol/L。以氯化镉水合物（CdCl2·2.5 H2O）作为镉源，加入去离子水溶解成0.1 mol/L 的Cd 溶液备用，试验过程中加入Hoagland’s 营养液中稀释至目标浓度。每个处理设置两个水培盒，每个水培盒8000 mL 处理液，6 株幼苗，每3 d 更换1 次处理液，处理14 d 后测定农艺性状和SPAD 值，对地上部鲜烟叶进行取样，测定其生理生化指标和Cd 含量。

1.3.2 外源MT 预处理对Cd 胁迫下烟草幼苗生长发育的影响 在不同Cd 胁迫试验中观察到100µmol/L 的Cd 能抑制烟草生长且抑制效果与150、200 µmol/L 无显著差异，所以褪黑素处理以100µmol/L Cd 胁迫为目标浓度设置6 个处理：无Cd营养液培养+叶面喷施清水为对照处理（CK）；100µmol/L Cd 胁迫+叶面喷施清水（Cd100）；100µmol/L Cd 胁迫+叶面喷施 10 µmol/L MT（10MT）;100 µmol/L Cd 胁迫+叶面喷施50 µmol/L MT（50MT）；100 µmol/L Cd 胁迫+叶面喷施100µmol/L MT（100MT）；100 µmol/L Cd 胁迫+叶面喷施200 µmol/L MT（200MT）。先用上述不同浓度的MT 处理液喷施烟苗，每盆每次喷施15 mL，喷至正反两面叶片均匀布满水滴为宜，连续喷施3 d 后进行Cd 处理；Cd 处理14 d 后测定农艺性状和SPAD值，按照1.3.1 方法取样测定生理生化指标和Cd含量。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 烟草农艺性状的测定 烟草幼苗根长、最大叶长、最大叶宽、株高用直尺测定；鲜质量用千分之一天平称量。

1.4.2 SPAD值的测定 于9:30—10:00使用手持叶绿素仪（SPAD-502Plus，Konica Minolta）进行测定。

1.4.3 生理生化指标测定 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、可溶性蛋白（SP）含量和过氧化氢酶（CAT）过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定均按照相关试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书提取并测定。

1.4.4 叶片Cd 含量测定 称取0.1 g 干燥烟草叶片样品加入5 mL HNO3，140 ℃消解至透明，将透明溶液用细菌过滤器过滤至新管并定容至25 mL，混匀备用，同时做试剂空白。用ICP-MS 测定叶片Cd2+含量（ICAPQ01937, Thermo Fisher Scientific, USA），具体操作方法见文献[18]。

1.4.5 数据分析 试验数据采用Microsoft Excel 2019 和SPSS 22.0 进行统计分析，利用GraphPad Prism 8.0.2 作图。并采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 法进行方差分析和显著性检验（p<0.05）。

2 结 果

2.1 不同Cd 浓度对烟草幼苗生长发育的影响

2.1.1 对烟草幼苗生长的影响 表1 结果显示，不同Cd 处理对烟草幼苗生长的影响程度不同。与对照相比，Cd 胁迫下烟草幼苗根长、鲜质量、最大叶长、最大叶宽、株高显著下降。且随着Cd 浓度的增加抑制程度增加，在200 μmol/L Cd 胁迫时抑制程度最大，其根长、鲜质量仅为对照的19.60%、15.86%；最大叶长、最大叶宽和株高为对照的29.01%、50.96%、22.86%。表明Cd 胁迫抑制了烟草的生长，减少了烟草生物量积累。

表1 不同Cd 浓度对烟草幼苗农艺性状的影响Table 1 The effect of different cadmium concentrations on agronomic characters of tobacco seedlings

2.1.2 对烟叶SPAD 值的影响 如图1 所示，50、100、150、200 μmol/L Cd 显著降低了烟草SPAD 值，分别为CK 的69.62%、50.30%、45.67%、34.41%。说明Cd 胁迫能显著减少烟叶叶绿素含量，抑制叶片光合色素的形成。

图1 不同Cd 胁迫对烟草幼苗SPAD 值的影响Fig. 1 Effects of different cadmium stress on SPAD value of tobacco seedlings

2.1.3 对烟叶MDA 含量的影响 结果显示（图2），Cd 胁迫显著增加了MDA 含量，50、100、150、200 μmol/L Cd处理的MDA含量分别为CK的1.57、2.47、5.59、5.45 倍。说明Cd 胁迫加剧了烟草幼苗膜脂过氧化。

图2 不同Cd 胁迫对烟草幼苗MDA 含量的影响Fig. 2 Effects of different cadmium stress on MDA content of tobacco seedlings

2.1.4 对烟叶抗氧化酶的影响 由图3 可知，Cd胁迫显著增加了烟叶中SOD、POD 活性，提高了GSH 含量，且随着Cd 浓度的增加，抗氧化酶活性逐渐增加。与无Cd 处理相比，50、100、150、200 μmol/L Cd 处理下烟叶 SOD 活性增加了10.14%、48.00%、147.78%、397.43%；POD 活性增加了930.05%、1 776.18%、18 823.59%、29 415.60%；GSH 含量增加了151.91%、664.42%、677.41%、1 807.51%。说明Cd 刺激了烟草自身保护系统，提高了自身抗氧化酶活性从而增加自身抗逆性。

图3 不同Cd 胁迫对烟草幼苗抗氧化酶的影响Fig. 3 Effects of different cadmium stress on antioxidant enzyme of tobacco seedlings

2.1.5 对烟叶可溶性蛋白含量的影响 图4 结果表明，50、100 μmol/L Cd 胁迫下可溶性蛋白含量无显著性变化，而150、200 μmol/L Cd 胁迫显著增加了可溶性蛋白含量，较对照处理增长了194.81%、354.65%，表明当Cd 浓度增加到一定程度时，烟草幼苗可积累可溶性蛋白，调控细胞渗透压从而抵御逆境胁迫危害。

图4 不同Cd 胁迫对烟草幼苗可溶性蛋白含量影响Fig. 4 Effects of different cadmium stress on soluble protein content of tobacco seedlings

2.1.6 对烟叶Cd2+含量的影响 结果如图5 所示，与不添加Cd 处理相比，Cd 胁迫（50～200 µmol/L）显著增加了烟草叶片Cd2+含量且200 μmol/L 处理最高为685.44 mg/kg，较对照处理增加了1 375.39%。说明Cd 胁迫能增加烟叶Cd2+含量，从而影响烟叶的产量和品质。

图5 不同Cd 胁迫对烟草叶片Cd2+含量影响Fig. 5 Effects of different cadmium stress on intracellular cadmium content in leaves of tobacco seedlings

2.2 外源MT 在不同浓度Cd 胁迫下的缓解效应

2.2.1 外源MT 对Cd 胁迫下烟草幼苗生长的影响 由表2 结果表明，随着MT 浓度的增加，烟苗的鲜质量、最大叶长、最大叶宽及株高均有增加且在200 μmol/L MT时达到最大，分别为Cd100的2.32、1.71、1.52、1.78 倍。然而外源MT 对Cd 胁迫下烟草根长无明显剂量效应，在10MT 和50MT 处理下烟草根长仅为单一Cd 处理的83.75%、87.50%，但150，200MT 处理下烟草根长有所增长，为单一Cd处理的100.00%、117.50%。以上结果表明外源MT能够促进Cd 胁迫下烟草幼苗生长，但不同农艺性状之间存在差异。

表2 外源MT 对Cd 胁迫下烟草幼苗生长的影响Table 2 Effects of exogenous MT on the growth of tobacco seedlings under cadmium stress

2.2.2 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶SPAD 值的影响 图6 所示，与CK 相比，单施Cd 处理（Cd100）显著降低了SPAD 值。Cd 胁迫下施加外源MT 能增加烟叶SPAD 值，且随着MT 浓度的增加呈持续增长的趋势。当MT 浓度为200 μmol/L 时，SPAD 值达到最高，相较于Cd100 增长了87.20%。说明外源MT 能够缓解100 μmol/L Cd 胁迫对叶绿素的破坏，促进叶片光合色素的形成。

图6 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶SPAD 值的影响Fig. 6 Effect of exogenous MT on SPAD value of tobacco leaves under cadmium stress

2.2.3 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶MDA 含量的影响 由图7 可知，与CK 相比，Cd100 处理下烟苗叶片MDA 含量显著上升，而MT 的加入降低了烟苗叶片的MDA 含量，10MT、50MT、100MT、200MT较Cd100 处理MDA 含量分别减少了12.77%、21.31%、34.38%、42.67%。说明褪黑素能降低烟草膜脂过氧化程度，缓解Cd 胁迫对植株的损伤。

图7 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶MDA 含量的影响Fig. 7 Effect of exogenous MT on MDA content in tobacco under cadmium stress

2.2.4 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶抗氧化酶活性的影响 由图8 可知，与CK 相比，Cd100 处理下烟苗叶片SOD、POD 活性和GSH 含量显著上升。而MT 预处理能进一步增加SOD、POD 活性和GSH含量，且随着MT 浓度的增加而增大，在200 μmol/L时达到最大值，较Cd100 增大391.20%、3 305.57%、332.11%。这说明外源MT 能提高烟草抗氧化能力，抵御Cd 胁迫带来的损伤。

图8 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶抗氧化酶的影响Fig. 8 Effect of exogenous MT on antioxidant enzymes in tobacco under cadmium stress

2.2.5 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶可溶性蛋白含量的影响 由图9 可知，与CK 相比，Cd100 处理下可溶性蛋白显著上升。与单一Cd 胁迫相比，10 和50 μmol/L MT 处理下可溶性蛋白含量变化不大，而100 μmol/L 和200 μmol/L MT 显著增加了可溶性蛋白含量，为Cd100 处理的157.88%、188.52%。这表明外源MT 能影响烟草可溶性蛋白含量从而增加烟草渗透调节能力，抵抗Cd 胁迫。

图9 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶可溶性蛋白含量的影响Fig. 9 Effect of exogenous MT on soluble protein content in tobacco under cadmium stress

2.2.6 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶胞内Cd2+含量的影响 如图10 所示，与CK 相比，Cd100 处理下叶片Cd2+含量显著上升。而MT 预处理有效地降低了烟苗叶片Cd2+含量，10、50、100、200 MT 处理下叶片Cd2+含量分别为395.51、258.33、246.14、217.15 mg/kg，为Cd100 处理的77.53%、50.64%、48.25%、42.56%。表明褪黑素能够显著降低烟叶Cd2+含量，从而降低Cd 对烟草的毒害作用。

图10 外源MT 对Cd 胁迫下烟叶Cd2+含量的影响Fig. 10 Effect of exogenous MT on intracellular cadmium content in tobacco leaves under cadmium stress

3 讨 论

Cd 作为一种影响植物生长发育的非必需重金属元素，经植物吸收后积累在植株体内，当积累到一定程度时，会出现各种毒害症状，如叶片发黄，叶片短小、主根和茎秆变短等。罗勇等[19]发现随着供Cd 水平的增加，烟苗逐渐矮化、主根变短，叶子发黄变小，与本研究结果一致。研究表明外源MT能够促进Cd 胁迫下植株生长，提高植株抗逆性[20]。本研究也表明，Cd 胁迫下烟草幼苗生长受到抑制，叶绿素含量显著降低，而外源MT（10～200 μmol/L）可不同程度提高烟草幼苗根长、鲜质量、最大叶长、最大叶宽、株高及叶绿素含量，这表明MT 能缓解Cd 胁迫带来的氧化损伤。除此之外，本研究还发现一定浓度的褪黑素可降低烟叶对Cd 的积累，这与黄科文等[21]、张珂等[22]研究结果一致。这可能是因为褪黑素能影响植株装载转运Cd 元素的相关基因转录水平，其机理还有待于进一步研究。

MDA 是膜脂过氧化的最终产物，从膜上产生的位置释放后，能与蛋白质、核酸反应使其功能丧失，还可使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成。因此，可通过MDA 含量了解膜脂过氧化程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。本研究中，Cd 胁迫显著增加了烟草体内MDA含量，说明Cd胁迫导致植株体内活性氧代谢失衡，膜脂过氧化加剧，激发自身活性氧清除系统，而喷施MT 可显著的降低MDA 的积累，说明MT 能降低膜脂过氧化程度，这与张珂等[22]研究一致。已有研究表明，MT 作为一种有效的抗氧化剂，能提高胁迫下植株的抗氧化酶活性，如和秋兰等[13]研究表明不同浓度的MT（50、100、150 μmol/L）预处理马铃薯幼苗后，可提高低温胁迫的SOD、POD、CAT活性。黄益宗等[23]将水稻幼苗置于砷胁迫下，发现未使用MT 的幼苗叶片和根的抗氧化酶活性均显著下降，但施加MT 可有效提高其活性。本研究也发现Cd 胁迫能增强烟草叶片SOD、POD、GSH 的活性，而外源MT 的加入使这些抗氧化酶活性得到进一步提高。

可溶性蛋白是一种重要的营养物质，具有可以调节细胞渗透压，保护细胞膜的功能，可作为植物渗透调节能力的表征指标。当植物遭到重金属毒害后，组织细胞会积累渗透调节物质来抵御逆境，以保证植物正常的生理活动。如佟莉蓉等[24]发现Cd胁迫能激发植物应激保护系统，增加体内可溶性蛋白、可溶性糖等含量提高束缚水的含量，保持原生质体的稳定从而增加其抗逆性；本试验也发现100 μmol/L Cd 胁迫能增加可溶性蛋白含量，而外源褪黑素能进一步增加可溶性蛋白含量，有效缓解了Cd对烟草幼苗细胞质膜的伤害。这与范海霞等[25]和徐宁等[26]研究结果一致。

4 结 论

本研究发现，Cd 胁迫（50～200 μmol/L）显著影响烟草幼苗的正常生长和干物质的积累，而外源MT（10～200 μmol/L）能够提高烟苗农艺性状、叶绿素含量、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量，降低烟叶Cd2+含量，从而缓解Cd 胁迫对烟草幼苗的伤害，提高植株抵抗Cd 的能力，且以200 μmol/L浓度MT 效果最佳。外源MT 提高烟草抗性的分子机制仍需进一步探究。