四磨汤对肝脾气滞证功能性消化不良大鼠十二指肠低度炎症及肥大细胞脱颗粒的影响

陈思清,徐 寅,蔺晓源,周赛男,韩运宗,刘 琴,陈龙彪,张海月,魏星旭

(1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2.湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是临床常见的消化系统功能性疾病,排除器质性病变后以早饱、餐后不适、烧心等为主要症状,约占消化道门诊病例的50%,严重影响了现代人的正常生活[1-2]。FD的发病机制尚没有统一的认知,多年来主要涉及胃-十二指肠动力减弱、肠道菌群变化及内脏敏感性增加等方面。最新研究表明[3-4],十二指肠低度炎症可能成为FD的又一主要致病机制。十二指肠组织局部炎性浸润主要表现为MC及嗜酸性粒细胞的局部聚集,肥大细胞(MC)脱颗粒释放的MC标记性蛋白类胰蛋白酶(Tryptase)、白介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等一系列活性物质能够直接作用于十二指肠局部,通过改变肠神经膜电位、影响肠道平滑肌甚至与中枢神经交联等导致胃肠道运动减弱及感觉过敏,从而产生早饱、烧灼感等一系列临床症状[5-7]。四磨汤起源于宋代的《重订严氏济生方》,被广大医家用于治疗FD,效果明确且无明显不良反应[8-10]。目前四磨汤治疗FD的具体机制仍在不断完善与探索中,本研究从十二指肠低度炎症出发,观察四磨汤对肝脾气滞证FD大鼠十二指肠Tryptase基因表达、血清IL-1β及TNF-α含量的影响,探究四磨汤治疗肝脾气滞证FD的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康SD大鼠60只,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,均为雄性大鼠,体重180～220 g。饲养温度24～26 ℃,湿度50%～70%。适应性饲养7 d后开始造模。

1.2 实验药物与主要试剂

1.2.1 实验药物:四磨汤方中人参、天台乌药、沉香各6 g,槟榔9 g。均购于湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房。生药用10倍蒸馏水浸泡0.5 h后加蒸馏水煎煮2次,第1次1.5 h,第2次1.0 h,合并2次滤液,过滤,浓缩,4 ℃保存待用。四磨汤组给药量分别为5.62、2.81、1.40 g/(kg·d)。灌胃容积均为1 ml/100 g 体重。莫沙必利(成都康弘药业集团股份有限公司,批号:2E019)。给药前用蒸馏水溶解,按人体用药量换算成大鼠等效剂量,给药量为0.305 mg/(kg·d),灌胃容积为1 ml/100 g体重。

1.2.2 主要试剂:大鼠IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司);大鼠TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司);Trizol(Invitrogen,批号:10296028);DEPC(MDL,批号:MD911875);Ultra Pure Agarose(ABI-invitrogen,批号:16500100);Super Script Ⅲ RT 逆转录kit(ABI-invitrogen,批号:11752050);Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen,批号:4472920)。

1.3 实验主要仪器 荧光定量PCR仪(Applied biosystems,型号:Step One Software);电泳仪(biorad,型号:EPS 300)。

1.4 实验方法 动物分组与模型制备:将大鼠随机分为六组,分别为空白组、模型组、西药组、四磨汤高剂量组、四磨汤中剂量组、四磨汤低剂量组。选取不可预知的慢性应激[11]对模型组及治疗组小鼠进行刺激,包括:食物剥夺(24 h);饮水剥夺合并空瓶刺激(12 h);倒悬(30 min);束缚(30 min);夹尾(1 h);明暗颠倒(24 h);湿笼饲养(24 h);超声刺激(2 h);强迫游泳(45 ℃,5 min)。每天随机选取上述九种刺激中的一种,刺激项目相邻的两天不重复,让动物无法预料刺激的发生,应激处理方法在每日上午8:30开始更换,连续刺激21 d,每种刺激方法平均使用2～3次。第22天,所有造模大鼠继续夹尾刺激以防止大鼠自愈,在此基础上治疗组分别每天灌胃相应剂量的治疗药物及正常饮食饮水,模型组正常饮食饮水并灌胃蒸馏水。连续灌胃14 d。根据大鼠一般状态、体重、胃排空率、小肠推进运动率及HE染色排除器质性病变判断造模是否成功[12]。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 一般状态观察:每日观察大鼠的皮毛色泽、精神状态、活动度、粪便性状等全身情况并测量体重。

1.5.2 胃排空率及小肠推进率的测定:提前准备好半固体制剂[13],末次给药后禁食不禁水24 h,用半固体制剂灌胃0.5 h后用3% 戊巴比妥钠5 ml/kg腹腔注射进行麻醉,麻醉完成后剖取全胃擦干后记录重量,然后称取胃内容物重量和胃净重;剖取小肠后铺于白纸,测量幽门至回盲肠部的长度(C)和幽门至半固体制剂的长度(L)胃排空率=[1-(胃总重-胃净重)/所给半固体制剂总重]×100%;肠推进率=L/C×100%。

1.5.3 实验动物取材与HE染色:麻醉后剖开大鼠胸腔,于腹主动脉取血5 ml,将全血标本置于室温静置2 h 后于4 ℃ 3000 r/min离心15 min,吸取上清,于-80 ℃条件下保存。随后冰盒上迅速取下大鼠的十二指肠组织,PBS漂洗后一部分置于4%多聚甲醛中固定,一部分置于液氮中速冻5 min,随后于-80 ℃冰箱中保存。将4%多聚甲醛固定的十二指肠组织用于HE染色。

1.5.4 RT-PCR检测Tryptase mRNA表达:为了检测Tryptase mRNA在组织中的表达水平,取适量组织至1.5 ml离心管中,采用Trizol提取细胞总RNA。使用逆转录试剂盒合成产物cDNA。然后对RNA进行相对测定,循环数和温度按试剂盒说明书设置,引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.5.5 ELISA法检测血清IL-1β及TNF-α含量:取出-80 ℃血清消融,采用ELISA法检测大鼠血清中IL-1β及TNF-α的水平,具体步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态 空白组大鼠皮毛润泽,精神状态良好,饮食饮水量正常,大便成形;模型组大鼠皮毛枯黄,性情暴躁而喜聚集于笼边,饮食饮水量减少,大便稀溏;治疗组大鼠较模型组大鼠温顺,皮毛顺泽,饮食饮水量增加,大便成形。

2.2 各组大鼠灌胃第14天体重比较 见表2。灌胃结束后,与空白组比较,模型组大鼠体重明显减轻(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠体重明显增加(P<0.01),其中四磨汤中剂量组与西药组体重增加明显,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠灌胃第14天体重比较(g)

2.3 各组大鼠胃排空率与小肠推进率比较 见表3。与空白组比较,模型组大鼠胃排空率与小肠推进率均明显降低(P<0.01);与模型组比较,除四磨汤低剂量组外,各治疗组大鼠的胃排空率与小肠推进率均显著上升(P<0.05)。

2.4 各组大鼠HE染色结果 HE染色观察各组大鼠十二指肠组织形态。结果显示,对照组细胞排列整齐,组织平整。与对照组比较,模型组大鼠十二指肠组织可见大量的肠绒毛上皮细胞脱落,固有层裸露,肠绒毛上皮细胞与固有层分离,肠绒毛形态不规则,肠绒毛上皮细胞未见明显的变性,固有层中肠腺数量丰富,排列整齐紧密,黏膜下层内结缔组织细密。各治疗组肠绒毛上皮细胞脱落及其与固有层分离现象均明显减少,肠绒毛形态规则,肠绒毛上皮细胞亦未见明显的变性,固有层中肠腺数量丰富,排列整齐紧密,黏膜下层内结缔组织细密(图1)。

图1 各组大鼠十二指肠黏膜组织病理学表现(HE染色,×100)

2.5 各组大鼠十二指肠Tryptase mRNA表达比较 见表4。RT-PCR法检测各组大鼠十二指肠Tryptase mRNA,与空白组相比,模型组大鼠十二指肠Tryptase基因的表达明显增加(P<0.01);与模型组相比,各治疗组大鼠十二指肠Tryptase基因的表达显著下降(P<0.01);且四磨汤中剂量组较四磨汤高剂量组Tryptase基因表达下降更为显著(P<0.01),说明四磨汤对Tryptase mRNA水平的调节作用的量效关系以中剂量最佳。

表4 各组大鼠十二指肠Tryptase mRNA表达比较

2.6 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比较 见表5。ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量,与空白组相比,模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显增加(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显下降(P<0.01)。

表5 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比较(pg/ml)

3 讨 论

十二指肠低度炎症是研究FD病理生理机制的一个新方向,而嗜酸性粒细胞以及MC等免疫细胞等的局部聚集及有关活性物质的释放是造成炎症的主要原因之一[14-16]。多项研究表明,FD患者中确实存在MC异常激活所造成的十二指肠低度炎症,其脱颗粒释放的一系列活性产物如TNF-α、白细胞介素、组胺、5-HT、Tryptase、白三烯、前列腺素等可以造成胃肠运动障碍,从而产生FD症状[14-17]。西药治疗FD多采用促动力药、质子泵抑制剂以及抗抑郁药等,治疗效果有限且不良反应较多,如促动力药导致的锥体外系反应、加重胃肠道出血等[18]。四磨汤由人参、乌药、槟榔以及沉香四味中药构成。现代药理学研究表明,四磨汤中的多味药均有与抵抗炎症相关的药理作用,如人参中的主要成分人参皂苷与人参多糖具有抗炎、抗氧化、调节免疫等作用[19];乌药中的主要成分乌药烷型倍半萜二聚体和三聚体具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用[20];槟榔中的槟榔碱具有消炎镇痛、促胃肠运动、抗氧化等作用[21]。本研究表明,四磨汤能降低肝脾气滞证FD大鼠十二指肠肥大细胞脱颗粒所释放的炎症介质含量以降低十二指肠低度炎症,与相关现代药理学研究结果一致。MC广泛分布于皮肤、消化道、呼吸道等部位,是人体重要的免疫细胞之一。胃肠道是人体最大的淋巴免疫器官,其免疫异常状态可导致免疫应答持续激活,产生持续的炎症[22]。MC的异常激活已被证实存在于FD患者的发病过程[17]。FD的一系列症状产生于持续的免疫激活与低度炎症,而MC脱颗粒释放的活性物质在此过程中可能发挥重要作用[14-16]。各种刺激因素激活MC后会使其脱颗粒释放出多种活性物质,Tryptase、IL-1β以及TNF-α均为具有致炎作用的重要活性物质[23]。

Tryptase作为MC的标记性蛋白,特异性地主要储存在于MC胞内,是MC脱颗粒释放出的主要活性物质,是MC激活与脱颗粒的象征[24]。常雄飞等[25]发现,健脾理气方能够抑制肥大细胞脱颗粒以降低Tryptase的表达、改善十二指肠紧密连接蛋白表达以治疗FD。IL-1β、TNF-α均为炎性介质网络的关键细胞因子,在多种炎症性疾病中发挥重要致炎作用[26-28]。本研究表明,四磨汤能显著减少肝脾气滞证FD大鼠十二指肠MC脱颗粒,降低十二指肠组织Tryptase基因表达及血清IL-1β、TNF-α含量,以缓解十二指肠局部低度炎症,改善FD症状。且四磨汤高剂量组对FD大鼠十二指肠组织Tryptase基因表达的抑制作用弱于四磨汤中剂量组,这说明四磨汤对肥大细胞脱颗粒的量效关系可能以中剂量最佳。

综上所述,本研究从十二指肠低度炎症出发,探索了四磨汤治疗FD的新方向,证明了四磨汤能降低肝脾气滞证FD大鼠十二指肠低度炎症及肥大细胞脱颗粒,以此改善模型大鼠FD症状。四磨汤的作用机制可能与四磨汤降低十二指肠低度炎症以影响肠上皮、神经、平滑肌等有关,但具体信号靶点及作用路径有待进一步探究。