松萝提取物对胶原诱导性关节炎大鼠HMGB1-RAGE自噬通路及关节炎性损伤的影响

谢良山　安阳　张军　黄颖　潘晓艺　徐晖

【摘 要】目的：探讨松萝提取物对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB1）-晚期糖基化终产物受体（RAGE）自噬通路及关节炎性损伤的影响。方法：将54只大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，松萝提取物低、中、高剂量组和羟氯喹组，每组9只。除空白对照组外，其余组采用Ⅱ型胶原乳剂建立CIA模型。松萝提取物低、中、高剂量组分别给予2 mg·kg-1·d-1、6 mg·kg-1·d-1、54 mg·kg-1·d-1松萝提取物灌胃，羟氯喹组给予36 mg·kg-1·d-1羟氯喹灌胃，空白对照组及模型对照组则予以等量的生理盐水灌胃。观察各组大鼠关节炎评分、肿胀程度和滑膜病理的变化，采用ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶（MMPs）、血管内皮生长因子（VEGF）、HMGB1的含量，PCR、WB检测蛋白HMGB1、RAGE、Beclin1、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的蛋白浓度及表达情况。结果：模型大鼠出现关节肿胀、变形，活动量减少，关节炎评分提示造模成功。经松萝提取物治疗后，大鼠的关节肿胀减轻，活动量增加，炎症反应减轻。与空白对照组比较，模型对照组血清TNF-α、MMPs、VEGF、HMGB1含量均增高，且HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK蛋白表达量均上升，Beclin1蛋白表达量下降（P < 0.05）。與模型对照组比较，松萝提取物中、高剂量组及羟氯喹组HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK、TNF-α、MMPs、VEGF含量均降低，Beclin1蛋白表达量上升（P < 0.05）；与羟氯喹组比较，松萝提取物中、高剂量组抑制HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK表达，激活Beclin1的效果相当，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：松萝提取物能减轻CIA大鼠关节肿胀程度，降低血清TNF-α、MMPs、VEGF、HMGB1含量，抑制HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK蛋白的表达，提升Beclin1表达，增强细胞自噬，减少滑膜炎症反应。

【关键词】 类风湿关节炎；胶原诱导性关节炎；松萝提取物；HMGB1；RAGE；细胞自噬；炎性损伤；大鼠

Effects of Usnea Extract on HMGB1-RAGE Autophagy Pathway and Arthritis Induced Injury in Collagen Induced Arthritis Rats

XIE Liang-shan，AN Yang，ZHANG Jun，HUANG Ying，PAN Xiao-yi，XU Hui

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of usnea extract on HMGB1-RAGE autophagy pathway and arthritis induced injury in collagen induced arthritis（CIA）rats.Methods：Fifty-four rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium and high dose groups of usnea extract and an Hydroxychloroquine control group，with 9 rats in each group.Except the blank control group，the other groups used type Ⅱcollagen emulsion to establish CIA models.The low，middle and high dose groups were given 2 mg·kg-1·d-1，6 mg·kg-1·d-1 and 54 mg·kg-1·d-1 respectively by gavage，the Hydroxychloroquine group was given36 mg·kg-1·d-1 of Hydroxychloroquine by gavage，and the blank control group and the model control group were given the same amount of normal saline by gavage.Observe the changes in joint score，swelling degree measurement，and synovial pathology of rats in each group，and detect the content of TNF-α，MMPs，VEGF and HMGB1 by ELISA.The protein concentration and expression of HMGB1，RAGE，Beclin1，Bcl-2，mTOR，p38 MAPK were detected by PCR and WB.Results：The model rats showed joint swelling and deformation，reduced activity，and arthritis scores indicating successful modeling.After treatment with usnea extract，the joint swelling of rats decreased，the activity increased，and the inflammatory response decreased.Compared with the blank control group，the concentrations of TNF-α，MMPs，VEGF，HMGB1 increased，and the expression levels of HMGB1，RAGE，Bcl-2，mTOR，and p38 MAPK proteins increased，while the expression levels of Beclin1 protein decreased（P < 0.05）.Compared with the model control group，the content of HMGB1，RAGE，Bcl-2，mTOR，p38 MAPK，TNF-α，MMPs and VEGF in the middle and high dose groups and the Hydroxychloroquine group decreased，while the expression of Beclin1 protein increased（P < 0.05）.Compared with the Hydroxychloroquine group，the middle and high dose groups had similar effects in inhibiting the expression of HMGB1，RAGE，Bcl-2，mTOR，p38 MAPK and activating Beclin1，with no statistically significant difference（P > 0.05）.Conclusion：Usnea extract can reduce the degree of joint swelling and concentrations of TNF-α，MMPs，VEGF，and HMGB1 in CIA rats，inhibit the expression of HMGB1，RAGE，Bcl-2，mTOR，and p38 MAPK proteins，increase the expression of Beclin1，and enhance cell viability.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;collagen induced arthritis;usnea extract;HMGB1;RAGE;cellular autophagy;inflammatory injury;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的以对称性、侵蚀性关节炎为主症的慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎为典型病理特征，最终导致关节畸形。研究发现，高迁移率族蛋白1（HMGB1）介导的细胞自噬与RA的疾病进程密切相关，是RA关节滑膜炎症反应及关节破坏的关键因素［1］。晚期糖基化终产物受体（RAGE）是与HMGB1结合最具亲和力的受体，两者结合，可启动经典的核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，促进炎症因子释放，诱发炎症反应，大量的炎症又会引发机体HMGB1及其受体RAGE的表达增加，从而形成双向反馈，导致炎症持续。因此，通过阻断HMGB1-RAGE通路可能是减轻炎症反应的重要手段。

侗族药松萝具有祛风除湿、通络止痛之功，松萝有效成分松萝酸具有抗炎、镇痛、抑制血管生成、减少炎性渗出等作用［2-3］。课题组前期研究显示，松萝制剂对RA具有良好疗效［4］，能够有效减轻胶原诱导性关节炎（CIA）模型大鼠关节肿胀，下调NF-κB相关蛋白的表达，降低滑膜炎症反应［5- 6］。本研究观察松萝提取物对CIA大鼠HMGB1-RAGE细胞自噬通路及关节炎性损伤的影响，现总结报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 选取SPF级5周龄Wistar雌性大鼠54只（由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供），实验动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0013，体质量160～180 g，免检合格。喂养环境室温20～25 ℃，湿度70%，自由进食、自由饮水，适应环境1周后开始实验，实验动物使用许可证号ky2020035。本研究已通过贵州中医药大学实验动物伦理审查委员会审批。

1.2 实验药品 松萝提取物，其主要成分为松萝酸（纯度 > 98%）（Solarbio，批号IU0130）；羟氯喹（Solarbio，批号IH0720）。

1.3 试剂与仪器 全自动酶标仪（Thermo Scientific，型号Multiskan MK3）；PCR仪（东胜创新生物科技有限公司，型号EDC-810）；垂直电泳槽（北京六一仪器厂，型号DYCZ-40）；实时荧光定量PCR仪（ABI，型号QuantStudio 6）；微量移液器（北京大龙公司，型号TopPette）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，型号DHG9203A）；Aquapro超级纯水仪（艾科浦，型号AJY-0501）；紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY02S）；水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY300）；分光光度计（上海舜宇恒科学仪器有限公司，型号752）。BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，批号P0010）；RIPA裂解液（碧云天，批号P0013B）；磷酸酶抑制剂（碧云天，批号S1873）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型的构建 将54只大鼠按照随机数字表法分为空白对照组，模型对照组，松萝提取物低、中、高剂量组和羟氯喹组，每组9只。除空白对照组外，其余组建立CIA模型，将Ⅱ型胶原蛋白溶于0.1 mol·L-1的冰醋酸中，配成1 mg·mL-1溶液，摇匀置于4 ℃冰箱过夜后，加入等体积的完全弗氏佐剂与之混合，充分混匀，乳化配制成Ⅱ型胶原乳剂，现配现用。分别于大鼠尾根部多点皮下注射配置好的胶原蛋白溶液0.1 mL致炎，复制稳定的CIA大鼠模型［7］。

2.2 模型大鼠关节炎评分 末次注射后，观察大鼠关节红肿程度及范围，对每只大鼠进行关节炎症评分。评分标准：0分，无红肿、疼痛；1分，小趾关节红斑或轻度肿胀；2分，趾关节、跖趾关节中度肿胀；3分，踝关节以下足爪重度肿胀；4分，跖趾关节至踝关节均肿胀。计算四肢关节的得分总和为该大鼠所得积分，> 4分为造模成功，最高为16分［8］。

2.3 给药处理 松萝提取物低、中、高剂量组分别给予2 mg·kg-1·d-1、6 mg·kg-1·d-1、54 mg·kg-1·d-1松萝提取物灌胃。成人羟氯喹用量为400 mg·d-1，参照成人与动物药物剂量研究换算，其相对应的换算系数为5.4，最终确定大鼠羟氯喹用药量为36 mg·kg-1·d-1。空白对照组及模型对照组则予以等量生理盐水灌胃。治疗28 d后进行取材。

2.4 样本采集 末次给药后，以0.4 mL·（100 g）-1乌拉坦溶液进行腹腔注射，麻醉后于股动脉取血4～6 mL，静置30 min后，置于离心机以3000 r·min-1離心15 min，离心半径10 cm，制备血清。处死大鼠后，解剖大鼠膝关节分离滑膜组织，提取组织蛋白。再将左踝关节滑膜以体积分数为10%的福尔马林液固定，用于病理切片分析。

2.5 观察指标

2.5.1 ELISA检测血清致炎因子 按照ELISA试剂盒说明书，检测血清致炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及细胞上清液中HMGB1、基质金属蛋白酶（MMPs）、血管内皮生长因子（VEGF）水平。按照试剂盒说明书，分别加样，37 ℃温育1 h，弃去液体，洗板3次；每孔加入酶标试剂，同等反应条件再洗板5 次；每孔加显色剂，酶标板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min；最后加入终止液，立即用酶标仪测量各孔的光密度，反复3次，取平均值。

2.5.2 关节滑膜组织中HMGB1、RAGE、Beclin1、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）蛋白浓度检测 采用Western Blot法检测，将组织细胞加入裂解液裂解，在自动匀浆机中匀浆完成后，置于冰上充分裂解。裂解30 min后，在4 ℃条件下离心机以12 000 r·min-1离心5 min，离心半径6 cm，取上清并置于-20 ℃保存。将蛋白样品以BSA为标准品进行稀释，稀释后每孔加入20 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离1.5 h后，准备PVDF膜和滤纸后开始转膜。用封闭液室温摇床封闭2 h，并用封闭液稀释相应的一抗。洗膜后，用TBST稀释相应的HRP标记二抗。反复洗膜5次后，放入显影液显影、定影液定影，用Western blot印迹观察，图像分析测定各带吸光度（A）值做定量分析。

2.5.3 关节滑膜组织中HMGB1、RAGE、Beclin1、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK mRNA表达检测 采用RT-PCR法检测HMGB1、RAGE、Beclin1、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK mRNA表达量。提取总RNA，逆转录合成cDNA，反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40个循环。引物序列见表1，每个样本3个副孔，重复3次。

2.5.4 透射电镜观察细胞自噬 待观察组织经固定、离心、洗涤、再固定、脱水、浸泡、包埋、修块、定位、切片、染色，然后在电镜下观察细胞自噬小体和自噬泡的形成。

2.6 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 松萝提取物对CIA大鼠血清中HMGB1、TNF-α、MMPs和VEGF含量的影响 与空白对照组比较，模型对照组HMGB1、TNF-α、MMPs和VEGF含量增高（P < 0.05）；与模型对照组比较，松萝提取物低、中、高剂量组及羟氯喹组HMGB1、TNF-α、MMPs、VEGF含量均降低（P < 0.05）；与羟氯喹组比较，松萝提取物中、高剂量组降低HMGB1、TNF-α、MMPs、VEGF含量效果相当，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3.2 松萝提取物对CIA大鼠关节滑膜组织中HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK、Beclin1 mRNA表达的影响 与空白对照组比较，模型对照组，松萝提取物低、中、高剂量组及羟氯喹组HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK均增加，Beclin1下降（P < 0.05）；与模型对照组比较，松萝提取物中、高剂量组及羟氯喹组均能激活Beclin1蛋白自噬，抑制HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK表达（P < 0.05）；与羟氯喹组比较，松萝提取物中、高剂量组抑制HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK表达，激活Beclin1的效果相当，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.3 松萝提取物对CIA大鼠关节滑膜组织中HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK、Beclin1蛋白表达的影响 与空白对照组比较，模型对照组，松萝提取物低、中、高剂量组及羟氯喹组滑膜组织中HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK蛋白相对表达量水平增高，Beclin1相对下降（P < 0.05）。与模型对照组比较，松萝提取物中、高剂量组及羟氯喹组HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR及p38 MAPK蛋白相对表达量显著下降，Beclin1增加（P < 0.05）。与羟氯喹组比较，松萝提取物中、高剂量组抑制HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK表达，激活Beclin1的效果相当，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3.4 松萝提取物对滑膜组织中细胞自噬病理变化的影响 空白对照组与模型对照组细胞中线粒体结构完整，有少量自噬体形成，维持正常细胞代谢需求；与空白对照组比较，松萝提取物中、高剂量组和羟氯喹组可见自噬小体数量增加，松萝提取物低剂量组自噬小体数量未见明显改变，松萝提取物中、高剂量组与羟氯喹组自噬小体数量明显增加，而炎症因子减少，细胞凋亡增加，提示松萝提取物可能通过调控细胞自噬达到抑制滑膜细胞炎症反应的作用。见图1。

4 讨 论

RA是一种病因未明的慢性炎性疾病，血管翳是关节炎性损害的病理基础。因CIA大鼠的症状表现與RA的表现相似，是研究RA的理想模型，故本文以CIA大鼠作为研究对象。研究发现，HMGB1作为一种炎症因子，与健康人相比，在RA患者关节滑膜及血清中的表达明显增高［9］，说明HMGB1可能与疾病的发生有关。RAGE作为一种免疫球蛋白，是HMGB1最具亲和力的受体。HMGB1通过与RAGE结合后，RAGE依赖性信号转导机制被激活，RAGE表达量增加，促使MAPK磷酸化、NF-κB向核内转移，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1（mTOR C1）的磷酸化，调节自噬的启动［10］，并通过激活胞外调节蛋白激酶（ERK），使Beclin1磷酸化，推动Beclin1与Bcl-2分离，调节细胞自噬的水平［11］。动物实验研究表明，在自噬刺激因素作用下，细胞核内HMGB1转移至细胞质直接与自噬因子Beclin1结合［12］，将Beclin1从凋亡抑制因子Bcl-2中分离［13］，激活自噬，最终导致炎症持续。另外，HMGB1介导的自噬通路还可导致关节的破坏。研究证明，在动物关节中单独注入HMGB1可诱导出类似于RA的关节炎破坏［14-17］，在关节炎模型动物中注入HMGB1抑制剂，可以控制炎症反应，使关节损伤的病情得以缓解［14］。当HMGB1与RAGE受体结合后，上调RAGE，启动经典的NF-κB炎症信号通路，释放TNF-α、MMPs等炎性因子，促进炎性细胞因子、趋化因子的产生，加重关节的损伤［17-19］。大量的促炎因子通过聚集于关节进一步促进HMGB1的分泌，形成正反馈环［20］。同时刺激VEGF、NF-κB等蛋白，HMGB1通过作用于p38 MAPK和NF-κB通路上调RAGE的表达，同时刺激VEGF的活化与增加，引起血管翳的形成，促使滑膜的异常增生及软骨破坏，最终导致关节破坏、受损［21］。

本研究结果显示，CIA模型大鼠均表现出相应的关节炎症症状，血清中TNF-α、MMPs、VEGF、HMGB1含量明显上升，HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR、p38 MAPK蛋白表达量均上升，Beclin1蛋白表达量下降，关节表现出明显炎症症状。通过松萝提取物、羟氯喹干预治疗后，CIA大鼠症状缓解，显著降低滑膜炎症反应，减少关节的肿胀，增加运动量，降低HMGB1、RAGE、Bcl-2、mTOR及p38 MAPK mRNA的表达量，促使Beclin1表达升高，同时血清中TNF-α、MMPs、VEGF水平明显下调，减轻关节炎症症状，阻断HMGB1-RAGE自噬通路，达到控制炎症及保护关节的目的。实验提示炎症时自噬是抑制状态，表明松萝提取物和羟氯喹对促进细胞自噬具有相同的作用。课题组在前期的临床和预实验研究中已证实松萝有效成分可以减少炎性细胞因子的分泌与释放，抑制滑膜的增生，改善RA患者的临床症状和体征，降低炎症指标，有效控制关节滑膜炎症。由此推测，松萝提取物可通过阻断HMGB1-RAGE自噬通路治疗CIA大鼠，控制炎症反应，防止炎性损伤导致的骨破坏。

综上所述，本实验通过构建CIA大鼠模型，证明松萝提取物通过抑制细胞自噬通路对其具有良好的治疗效果，明显改善了CIA大鼠症状以及滑膜组织中炎性细胞的浸润，作用机制可能与其阻断HMGB1-RAGE自噬通路从而减少促炎因子产生有关，该实验研究将为临床治疗RA提供理论研究基础。因其研究的方面略有不足，所以还有待于更进一步的研究。

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收稿日期：2023-05-16；修回日期：2023-06-27