小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定*

辛晨, 况春燕*, 刘兴德

(1.贵州医科大学附属人民医院 心内科, 贵州 贵阳 550003; 2.贵州省人民医院 心内科, 贵州 贵阳 550003; 3.贵州中医药大学 心内科, 贵州 贵阳 550003)

在研究T细胞谱系的小鼠过程时Schwarz首次发现Schlafen(Slfn)基因家族,该基因家族仅存在于哺乳动物中[1];也有研究认为 Slfn基因在细胞增殖、分化和凋亡等方面具有重要的作用[2-3]。Slfn家族成员在哺乳动物中广泛地表达,但是该家族基因成员在小鼠中的组成部分与人类中的组成部分有所不同[4],小鼠Slfn家族基因的成员有Slfn1、Slfn1L、Slfn2、Slfn3、Slfn4、Slfn5、Slfn8、Slfn9、Slfn10及Slfn14共10个,而组成人类Slfn家族基因的成员只有Slfn5、Slfn11、Slfn12、Slfn13及Slfn14共5个,其中Slfn5和Slfn14是人类和小鼠中共存的Slfn家族基因[5-6]。Slfn家族成员根据其基因/蛋白质大小、序列的同源性以及结构域有所不同,又被划分为3个亚组[7],目前科研人员对Slfn家族基因的分子功能知之甚少。已有研究显示,Slfn1在大鼠内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)中表达,可调节EPCs的生物学行为,且Slfn1在体外是EPCs增殖和管形成的强大负性调节因子[8-9],然而Slfn3是否能够像同家族成员Slfn1一样,对心血管系统起到调控作用、并对EPCs的增殖及迁移产生影响到目前为止尚未见报道。因此,为了后续更加深入地探讨Slfn3基因对EPCs多种生物学行为的影响,本研究构建了小鼠短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)-Slfn3重组腺病毒以供体外感染小鼠脾源EPCs,检测其在EPCs中的转染效果,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物、细胞及载体 4～8周龄雄性C57小鼠(重庆贝莱康生物);人胚胎肾细胞HEK293和pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP载体(上海和元生物),大肠杆菌DH5a感受态细胞(日本Takara)。

1.1.2主要试剂和仪器 胎牛血清、改良Eagle(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培养基(美国Gibco),高保真 Prime STAR酶、TaqDNA聚合酶及T4 DNA连接酶(日本Takara),胰蛋白酶(美国Hyclone),质粒DNA小量抽提试剂盒和质粒纯化试剂盒(美国Axygen),限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ(华大基因),电热恒温水槽(上海一恒),PCR仪(美国Applied Biosystems),移液器(德国Eppendorf),DNA电泳槽(上海天能科技),凝胶成像分析仪(培清科技),超微量分光光度计(北京凯奥科技),冷冻高速离心机(美国Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1干扰载体的构建 利用GenBank基因软件获得了Slfn3基因(NM_011409.1)序列及其上游和下游的序列,并根据其序列设计合成3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点及1条无义的阴性对照(negative control,NC),siRNA-Slfn3(1)为CTCAATCTCAGATGAAGTGAA,siRNA-Slfn3(2)为AGCAGAATCCAGACCAAGTTC,siRNA-Slfn3(3)为ATCCAGGACAGATCCCGAAGA,NC为CCCGGACTGTAAACTACAGAT;人工合成上述4对引物(表1)[10-11]。利用限制性内切酶AgeⅠ和 EcoRⅠ对载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP进行双酶切,使其线性化后,将目的基因Slfn3与其连接,连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,置于含卡那霉素抗性的细菌基础培养液培养,于37 ℃、5%CO2条件下孵育过夜,PCR鉴定挑选出阳性克隆,并对阳性克隆进行DNA测序验证[10,12];经DNA测序验证正确的质粒依次命名为shRNA-Slfn3(1)、shRNA-Slfn3(2)、shRNA-Slfn3(3)及shRNA-Slfn3(NC),并提取质粒。测序正向引物序列为CCGGCTCAATCTCAGATGAAGTGAACTCGAGTTCACTTCATCTGAGATTGAGTTTTTTG,位于人U6启动子序列中;反向引物序列为AATTCAAAAACTCAATCTCAGATGAAGTGAACTCGAGTTCACTTCATCTGAGATTGAG,位于CMV启动子的5序列。

表1 构建的病毒载体框架序列

1.2.2腺病毒的包装、扩增和滴度测定 取HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37 ℃、5%CO2的条件下培养;运用Admax系统,将先前所得的3个穿梭质粒分别转染到HEK293细胞中,得重组腺病毒shRNA-Slfn3;HEK293细胞种植于6孔板之中,等到其生长至密度为70%～80%的时候,去除原培养基,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗2次,加Opti-MEM无血清培养基1.5×10-3/L,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养1 h;骨架质粒和穿梭质粒按1∶1均匀混合制备得病毒载体质粒,取病毒载体质粒4 μg 按2.5×10-4/L加入含Opti-MEM 无血清培养基的培养液中,混合均匀,再加腺病毒包装转染试剂室温放置20 min,待转染复合体状态稳定后在先前培养HEK293细胞的6孔板之内加入上述所得的转染复合体,37 ℃、5%CO2条件下培养6 h,吸取原有的旧培养基,再加2×10-3/L新鲜培养基,37 ℃、5%CO2培养箱中培养, 每隔3 d换液1次,出现病毒空斑则停止换液处理,待所有细胞完全发生病变后采集上清液[12-13]。将HEK293细胞直接接种于规格为10 cm×10 cm×2 cm的培养皿中,待细胞生长密度达到90%以上,加合适度的病毒感染细胞;待细胞全部病变后,收取病毒并分装[10,14]。将生长状态良好的HEK293细胞接种于24孔板,每孔种植的细胞数量为5.0×105个,放入37 ℃、5%CO2的培养箱培养;等细胞的生长密度达到90%以上,分别将病毒液按照10-5～10-8的浓度梯度进行稀释,按1×10-4/L依次加入接种有HEK293细胞的24孔板中,待病毒感染细胞48 h;运用光学显微镜进行观察,每个培养孔中随机选择5个观察视野,统计阳性细胞的数目,并计算每个培养孔内阳性细胞的平均数目及病毒的滴度[12-13]。

1.2.3小鼠EPCs的培养 断颈法处死C57小鼠,取其脾脏剪碎研磨,用PBS冲洗过滤获得细胞悬液。将淋巴细胞分离液与细胞悬液以1∶4的比例(切勿混匀)加入离心管,放入水平离心机,4 ℃条件下2 000 r/min离心20 min。离心后的液体被分为4层,其中单个核细胞位于第2层、呈薄薄的白膜层,将其吸出放入离心管,1 500 r/min离心10 min;弃上清,加PBS洗涤3次,培养于含20%胎牛血清及青霉素-链霉素双抗溶液的低葡萄糖L-DMEM培养基中,每隔48 h换液1次,待细胞生长密度达70%时进行转染。

1.2.4shRNA-Slfn3转染EPCs 取生长密度达到70%的EPCs,加shRNA-Slfn3进行病毒转染EPCs 至48 h,应用荧光显微镜检测视野内的染上EGFP的细胞(绿色荧光细胞),计算细胞转染效率(转染效率=视野内可见的绿色荧光细胞数量/总细胞数量×100%)。

2 结果

2.1 目的穿梭质粒的鉴定

利用测序软件对4组序列进行DNA测序分析验证。结果显示,3组shRNA-Slfn3以及1组对照序列内均含有设计的目的序列(图1),表明目的穿梭质粒构建成功。

2.2 重组腺病毒的包装

将DNA测序无误的shRNA-Slfn3与辅助质粒一同转染到HEK293细胞,转染后13 d左右即可在光学显微镜下观察到细胞大量漂浮,且细胞呈现绿色荧光,最后收集细胞得重组腺病毒。见图2。

注：绿色荧光表示转染上shRNA-slfn3质粒的细胞。

2.3 重组腺病毒的扩增

将收集得到的病毒再次用于感染HEK293细胞进行病毒扩增,可以在荧光显微镜下观察到大量EGFP的表达(图3)。

2.4 重组病毒的滴度

重组病毒滴度的结果显示,shRNA-Slfn3(1)、shRNA-Slfn3(2)及shRNA-Slfn3(3)的病毒滴度分别为2.37×1013pfu/L、3.16×1013pfu/L及4.74×1013pfu/L。

2.5 shRNA-Slfn3 转染EPCs

用shRNA-Slfn3转染EPCs 48h,荧光显微镜下观察到细胞中有强绿色荧光效应,则为成功地转染上shRNA-Slfn3的EPCs,转染效率为(67.64±2.58)%。见图4。

图4 EPCs转染shRNA-Slfn3 48 h后荧光的表达(100×)

3 讨论

本研究构建了小鼠shRNA-Slfn3的重组腺病毒质粒,并且进行了腺病毒的包装,为Slfn3基因后续研究奠定了基础;成功地从小鼠脾脏提取到EPCs,在体外培养,并用构建的小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒质粒成功转染到EPCs中,为后续Slfn3基因和EPCs的相关研究提供了可靠的保障。

多年来,许多研究者对大多数Slfn家族基因的功能进行了深入研究,尽管Slfn家族不同基因和蛋白质的确切功能还尚待确定,但是有最新的研究证据表明,该家族的多个成员参与了发育、免疫反应和细胞的增殖[15]。在胸腺细胞的成熟过程和T细胞的发育过程之中,Slfn家族成员的表达呈显著上调,与之相反的是其在胸腺瘤细胞和成纤维细胞中的表达则为抑制细胞的增殖[16]。Slfn3基因隶属于Slfn家族的第二亚群,蛋白分子的大小介于58～68 kDa,其蛋白结构中包含有一个“SLFN盒”,与一个不同的AAA结构域相邻,还有一个此亚群特有但功能未知的高度保守的“Ser-Trp-Ala-Asp-Leu(SWADL)”结构域[17]。最新研究已经确定Slfn3基因是外围CD4+CD25+T细胞中过度表达的基因,可以在T细胞分化和激活中发挥作用,并可能成为T细胞激活的新标志物。在T细胞激活和增殖的时候,Slfn3基因的mRNA在CD4+CD25+Tregs中呈现出下调的趋势,与此不同的是,其在CD4+CD25-Teffs中受到明显上调。而且TGF-β能够抑制Slfn3基因在抗CD3/CD28激活的CD4+T细胞中的表达[18]。此外,Slfn3基因已经被证实是细胞增殖的负性调节剂,其能够在体内和体外介导啮齿动物肠细胞的分化,并且Slfn3基因的表达可以明显抑制富含癌干细胞、抗FOLFOX的结肠癌细胞的多种特征,它的表达可能会使结肠癌更容易受到癌症化疗的影响[19]。在更进一步的研究中还发现,Slfn3基因在 EPCs 中也有明显的表达,先前有研究证实另一Slfn家族成员Slfn1被证实在大鼠EPCs中表达并且调节EPCs的生物学行为,由此可以推测Slfn3也在心血管系统中发挥着重要的作用,极有可能参与了心血管疾病的发生发展过程。然而,目前Slfn3基因在这方面的研究少之又少,这极大地限制了其临床应用。

科研人员经常通过操纵某个基因的表达来研究这个基因的功能,降低目的基因的表达或者完全敲除目的基因是最常用的两种方法[20]。其中敲减基因的方法多种多样,比如siRNA、shRNA及CRISPR-CasRx等。本研究采用的是shRNA敲低技术,shRNA是一种类似于发卡状的短颈环结构,通常是借助质粒病毒等载体导入细胞内,需要经细胞内的酶进行切割,才能转变成siRNA而发挥作用[21];shRNA被连接在病毒载体上,以DNA的形式导入细胞,在细胞核内,被转录为pri-miRNA,细胞内的Drosha酶修剪pri-miRNA的两端序列,使其变成一种具有颈环结构的小RNA(microRNA, miRNA),即shRNA的前体pre-shRNA;接下来pre-shRNA从细胞核内游走到细胞质,在细胞质内形成了成熟的shRNA;在细胞质内的Dicer酶作用下,shRNA的环状结构被切掉,只剩下核心的siRNA序列;siRNA可以降解mRNA,干扰翻译过程,从而降低蛋白质的表达水平。与siRNA的瞬态效果相比,shRNA虽然发挥作用的过程更加复杂,但是其可以通过病毒载体整合到基因组内,更加稳定地表达,并且能够长久持续地发挥作用[22]。基因敲减技术在这些年不断地取得进步和创新,已经从最开始最基本的将目的基因完全敲除,发展到现在可以在特定的组织、特定的时间敲除目的基因,在特异性得到了提高的同时,基因敲除的效率也得到了显著的提高。基因敲减技术在基因组学中的广泛应用,极大地推动了全球医学领域研究的不断发展和进步。

本研究选用Slfn3作为目的基因片段,pADV-U6-shRNA- CMV-EGFP作为干扰载体,Slfn3基因片段被成功地插入到重组腺病毒载体中,构建了shRNA-Slfn3重组腺病毒;并对小鼠脾源EPCs进行了体外培养,用该重组腺病毒能够成功感染EPCs,转染效率为(63.64±2.58)%,为更进一步研究利用腺病毒敲低Slfn3基因表达在EPCs生物学功能中的作用打下了基础。