牛角花齿蓟马对4种牧草花及其挥发物的行为选择反应

崔晓宁，赵晓东，席驳鑫，胡桂馨，尚素琴，彭 斌，史薛强

（1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/国家林业草原高寒草地鼠害防控工程技术研究中心，兰州 730070；2.甘肃省平凉市崆峒区农业农村局，平凉 744000；3.甘肃农业大学植物保护学院，兰州 730070）

牛角花齿蓟马Odontothripsloti属于缨翅目Thysanoptera，蓟马科Thripidae，齿蓟马属Odontothrips，主要营孤雌生殖，是我国北方苜蓿上重要害虫之一[1,2]。在苜蓿营养生长阶段，牛角花齿蓟马为害苜蓿顶端嫩叶，使植株叶片皱缩、卷曲，降低光合效率；待苜蓿开花后，蓟马则转移到花器中活动，造成花荚脱落[3-5]。在我国西北苜蓿产区，牛角花齿蓟马在田间的虫害率可达70%～100%，降低苜蓿粗蛋白含量8.86%～11.56%，氨基酸总量下降35.0%以上，严重影响苜蓿鲜草、种子的品质和产量[6,7]。目前的防控主要以化学防治为主，长期使用不仅影响环境安全，还易使害虫产生抗药性，这严重制约草牧业的高质量发展，亟需探索新的防控技术。

植物花释放的挥发物是影响蓟马长距离寄主选择的重要因素之一。西花蓟马Frankliniellaoccidentalis寄主广泛，如万寿菊Tageteserecta[8]、非洲菊Gerberajamesonii[9]、黄花美人蕉Cannaceaeindicavar.flava[10]、康乃馨Dianthuscaryophyllus[9]、玫瑰Rosarugosa[11]、月季R.chinensis[12]等多种花卉能吸引西花蓟马趋向活动，寄主释放的茶螺烷、壬醛和2-乙酸-苯乙酯等对西花蓟马有很强的引诱作用[11]。迷迭香Rosmarinus officinialis花对西花蓟马、烟蓟马Thripstabaci、棕榈蓟马Thripspalmi均有明显的忌避效果，桉油精是导致蓟马产生忌避反应的主要组分[13,14]。因此，生产上常栽植一些能够引诱或驱避蓟马的植物进行生态防控[15,16]。利用植物源引诱剂对蓟马进行种群监测和诱杀的技术具有广阔的应用前景[17]。研究表明，将寄主化合物茴香醛与诱虫板结合可增加西花蓟马诱捕数量的1.8～6 倍[18,19]；异烟酸甲酯被证明对西花蓟马、花蓟马F.intonsa、烟蓟马和棕榈蓟马等12 种蓟马具有很强的引诱效果，与诱虫板结合使用可提高对西花蓟马诱捕量的2.4～4 倍；异烟酸甲酯对蓟马具有广谱和高效的引诱活性，在欧洲广泛应用于多种蓟马的生态防治[20-22]。异烟酸甲酯对天敌小花蝽也具有较强的吸引作用，将该物质与天敌昆虫结合使用可显著增强蓟马的生物防效[21]。

牛角花齿蓟马的寄主植物主要有苜蓿属Medicagospp.、草木樨属Melilotusspp.和车轴草属Trifoliumspp.等豆科牧草[2]。紫花苜蓿M.sativa、黄花草木樨Melilotusofficinalis、红豆草Onobrychisviciaefolia和红三叶Trifoliumpratense是我国重要的豆科饲草植物。田间调查发现，牛角花齿蓟马对这4 种牧草花表现不同的为害程度，其中对紫花苜蓿的为害最严重。为探讨植物挥发物对牛角花齿蓟马寄主选择的影响，本研究选取紫花苜蓿、黄花草木樨、红豆草和红三叶4 种豆科牧草的花为研究对象，测试牛角花齿蓟马对寄主花的气味偏好性，分析相关挥发物组分构成及含量差异，以期明确牛角花齿蓟马的寄主选择机制，为开发植物源引诱剂的害虫绿色监控技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试昆虫 牛角花齿蓟马雌成虫采自甘肃农业大学牧草试验田，寄主为“清水”紫花苜蓿。室内盆栽“清水”紫花苜蓿罩笼饲养2 代后，再挑选若干雌成虫到塑料养虫罐（直径6 cm，高5 cm）中饲养。罐底铺一层滤纸，加入少量健康的苜蓿嫩叶，用湿脱脂棉包裹叶柄保持叶片新鲜。选取同日龄的蓟马雌成虫用于嗅觉选择行为测试。

1.1.2 供试植物 4 种豆科牧草，“甘农3 号”紫花苜蓿、黄花草木樨、“甘肃”红豆草和“甘红一号”红三叶。4 种牧草盆栽埋地种植于甘肃农业大学牧草试验地塑料温室，用细纱封住网室入口防止害虫侵入，待盛花期采集健康植株的花朵用于嗅觉行为测试和挥发物收集。

1.1.3 仪器和试剂 大气采样仪QC-1B 型，购自北京科安劳保新技术公司；Y 型玻璃嗅觉仪，直径1.0 cm，基臂长10 cm，测试臂长15 cm；气相色谱-质谱联用仪（7890B+7000D，美国Agilent，GC-MS）；Paropak Q 吸附剂（80～100 目）购自美国Waters 公司；正己烷（HPLC 级）购自阿拉丁公司。

1.2 牛角花齿蓟马对4 种寄主花的嗅觉行为选择

嗅觉行为测试组装：大气采样仪→活性炭（除杂）→蒸馏水（加湿）→气体流量计→味源瓶（玻璃洗气瓶）→Y 型嗅觉仪。Y 管两臂用医用硅胶软管与味源瓶相连，味源瓶（250 mL）内放入植物花的鲜样20 g为测试植物。两测试管臂中各放一根细铁丝引导蓟马爬行，两臂气体流速调节为100 mL/min。嗅觉仪用纸箱遮盖，悬挂1 根白色节能灯管作为补充光源。试验在室温条件下进行，每天测试时间为10：00～16：00，此时蓟马行为活跃，测试前试虫饥饿处理1 h。每次测试放入1 头蓟马，5 min 后检查记录两测试臂和基臂中的试虫，测定1 次交换两测试臂的位置。每种牧草处理测试60 头，每头仅测试一次。每测试10 头蓟马更换Y 型嗅觉仪，每测试30 头更换测试植物。嗅觉仪用75%乙醇擦拭，清水冲洗后烘干再用。

单项选择试验以空气为对照，两项选择试验4 种豆科牧草间相互比较。蓟马对植物气味的选择反应率计算参考陈泓渝等[23]的方法，公式如下：

选择反应率（R）＝味源臂试虫数/（味源臂试虫数＋对照臂试虫数）×100%。

1.3 寄主植物花挥发物的采集和化合物鉴定

1.3.1 挥发物采集 采用动态顶空吸附法采集牧草花释放的挥发物[24]。聚四氟乙烯管、洗气瓶、玻璃吸附柱（内径0.5 cm，长度10 cm）等组成密闭的循环系统：大气采样仪（进气）→活性炭（除空气杂质）→样品瓶（玻璃洗气瓶，250 mL）→吸附剂柱→大气采样仪（出气）。吸附柱中装入Paropak Q 吸附剂100 mg/管，用玻璃棉塞住两端管口。每个样品瓶中装入新鲜的牧草花朵约35 g，每种牧草处理4 个重复。挥发物采集气体流速为300 mL/min，采集时间5 h，以空气为空白对照。采集结束将植物样品在烘箱（70 ℃）中烘至恒重，称取干重。

1.3.2 化合物鉴定及含量分析 挥发物采集结束后取下吸附柱，用正己烷（HPLC 级）淋洗至1.5 mL，0.22 μm滤膜过滤后，在冰浴条件下氮气（纯度99.99%）浓缩至0.5 mL，保存于-20 ℃冰箱。挥发物样品进行气相色谱-质谱测试，上样量1.0 μL。气相色谱使用HP-5 色谱柱，升温程序：40 ℃保持1 min，6 ℃/min 升温至230 ℃保持5 min，以氦气作为载气（1.0 mL/min），无分流进样，溶剂延迟3 min。气相色谱进样口温度200 ℃，传输线温度250 ℃。质谱（EI，70 eV）质量扫描范围40～500 μ，发射电流150 μA，离子源温度230 ℃。比对NIST 2017 标准谱图，根据保留时间、保留指数和匹配度鉴定化合物。每种挥发性化合物的相对含量采用内标法（乙酸庚酯）定量，每种化合物的含量以植物干物质中的物质含量表示（ng/g）[25]。

1.4 数据统计与分析

所有数据采用SPSS 20.0 软件处理。单项选择和两项选择反应率差异比较采用非参数卡方检验（chi-square test，χ2test，α＝0.05）；每种挥发性化合物的含量在两种植物间的差异比较采用独立样本t检验（α＝0.05），3 个及以上植物间的含量差异比较采用单因素方差分析（Duncan’s HSD，α＝0.05）。对4 种植物挥发物的含量进行因子分析，利用主成分方法提取3 个因子，采用Kaiser 标准化正交旋转法，构建旋转成份矩阵，获得每种挥发物在各个因子上的载荷值。将每种化合物在3 个因子上的成份得分系数回归化获得每种植物的因子得分。利用单因素方差分析（Duncan’s HSD，α＝0.05）比较每个因子中不同植物间的因子得分差异，选取因子1 和2 的得分绘制二维分布图[25]。

2 结果与分析

2.1 牛角花齿蓟马对4 种牧草花的嗅觉行为选择

与空气对照比较，牛角花齿蓟马对紫花苜蓿具有显著的正选择趋性，选择反应率为70.6%（χ2=8.647，P=0.003）。牛角花齿蓟马对其他3 种牧草的选择反应率与对照相比无显著差异，蓟马对黄花草木樨、红豆草和红三叶的选择反应率分别为63.6%（χ2＝3.273，P＝0.07）、43.5%（χ2=0.783，P=0.376）和59.6%（χ2=1.923，P=0.166）（图1）。

图1 单项选择条件下牛角花齿蓟马对4 种豆科牧草花的嗅觉行为反应Fig.1 Single-choice olfactory behavioral responses of Odontothrips loti females to floral volatiles emitted by four tested plants

两两嗅觉行为选择表明，牛角花齿蓟马对紫花苜蓿的选择趋性显著高于红豆草和红三叶，选择反应率分别为紫花苜蓿78.3%，红豆草21.7%（χ2=14.696，P<0.001）；紫花苜蓿68.7%，红三叶31.3%（χ2=6.75，P=0.009）。牛角花齿蓟马对紫花苜蓿（R=56.8%）的选择趋性与草木樨（R=43.2%）相比无显著差异（χ2=0.818，P=0.366）。与红豆草和红三叶比较，牛角花齿蓟马对草木樨的选择趋性与这两种牧草均无显著差异，选择反应率分别为草木樨60.5%，红豆草39.5%（χ2=1.684，P=0.194）；草木樨59.5%，红三叶40.5%（χ2=1.324，P=0.25）。牛角花齿蓟马对红三叶的选择趋性与红豆草相比无显著差异，选择反应率为红三叶60.0%，红豆草40.0%（χ2=1.6，P=0.206）（图2）。

图2 两两选择条件下牛角花齿蓟马对4 种豆科牧草花的嗅觉行为反应Fig.2 Dual-choice olfactory behavioral responses of Odontothrips loti females to floral volatiles emitted by four tested plants

2.2 4 种寄主花的挥发物组分及含量分析

4 种豆科牧草花释放的挥发物共鉴定到40 种化合物（表1），包括烷烃1 种，醇类9 种，酮类2 种，醛类5 种，酯类9 种，萜烯类13 种，酚类1 种。紫花苜蓿花释放的挥发物组分有32 种，其中14 种物质为紫花苜蓿特有组分，分别为α-松油醇、2-茨醇、绿花白千层醇、柏木脑、3,4-二甲基苯乙酮、苯甲醛、邻甲氧基肉桂醛、肉桂酸甲酯、甲酸芳樟酯、月桂酸甲酯、十五烷酸甲酯、棕榈油酸甲酯、桧烯、白菖烯。草木樨花释放的挥发物组分有24 种，其特有组分有5 种，分别是喇叭茶醇、马兜铃烯、α-律草烯、β-石竹烯和香橙烯。红豆草花的挥发物组分有14 种，月桂烯是其特有物质。红三叶花释放的挥发物组分最少，有7 种，癸醛是其特有物质。庚烷、肉桂酸芳樟酯、5-甲基-1-己烯和α-衣兰油烯这4 种物质仅存在于紫花苜蓿和草木樨花的挥发物中。

表1 4 种豆科牧草花释放的挥发物组分和含量Table 1 The component and content of floral volatiles released from four different tested plants (ng/g)

2.3 4 种寄主花释放的挥发物含量的因子分析

4 种豆科牧草花释放的挥发物含量因子分析表明（表2），以主成分方法提取的前3 个因子累计解释了总方差的96.75%。构成因子1 的挥发物组分对总方差的解释概率为52.65%，贡献率较大（绝对值＞0.7）的物质有22 种，分别是十五烷酸甲酯、邻甲氧基肉桂醛、3,4-二甲基苯乙酮、2-茨醇、α-松油醇、桧烯、肉桂酸甲酯、棕榈油酸甲酯、绿花白千层醇、白菖烯、柏木脑、月桂酸甲酯、蓝桉醇、苯甲醛、甲酸芳樟酯、α-蒎烯、δ-杜松烯、3-异丙基苯甲醛、棕榈酸甲酯、肉桂酸芳樟酯、5-甲基-1-己烯和庚烷。构成因子2的挥发物组分对总方差的解释概率为24.47%，贡献率较大的组分有7 种，分别是α-衣兰油烯、马兜铃烯、α-律草烯、香橙烯、β-石竹烯、1-甲氧基-2-茚醇和喇叭茶醇。构成因子3 的挥发物组分对总方差的解释概率为15.63%，贡献率较大的组分有肉桂醛、百里酚、癸醛、4-乙基苯甲酸甲酯、4-异丙基苯甲醇、月桂烯和萜品-4-醇7 种物质。每个因子中挥发物组分的因子得分在4 种豆科牧草间均存在显著差异，对因子1、2、3 得分贡献最高的分别是紫花苜蓿、草木樨，以及红豆草和红三叶的挥发物组分。

表2 4 种豆科牧草花释放的挥发物含量的因子分析Table 2 Factor analysis of the content of floral volatiles released from four different tested plants

根据组成因子1 和因子2 的挥发物的因子得分绘制的主成分图（图3）表明，紫花苜蓿分布在二维图的右下部，草木樨分布在左上部，两者分布位置较远，说明紫花苜蓿和草木樨之间的挥发物组分构成和含量存在较大差异。红豆草和红三叶分布在二维图的左下部，两者之间分布位置较近，说明这两种牧草的挥发物在组分构成和含量上差异较小，但他们均与紫花苜蓿或草木樨的挥发物在组成和含量上存在较大差异。

图3 以4 种豆科牧草花释放的挥发物含量的因子得分构成的主成分图Fig.3 Principal component analysis of floral volatile contents of four different tested plants

3 讨论

蓟马类害虫对寄主植物的花表现出不同程度的选择偏好性。如曹宇等[10]发现西花蓟马对花的选择偏好为黄花美人蕉＞黄花槐Sophoraxanthantha＞凤尾兰Yuccagloriosa＞夹竹桃Neriumoleander；黄胸蓟马Thripshawaiiensis对花的嗅觉行为选择为洋桔梗Eustomagrandiflorum＞杜鹃Rhododendronsimsii＞百合Liliumbrownie＞菊花Dendranthemamorifolium[26]。蓟马的这种嗅觉选择偏好性不仅影响对寄主植物的定位和取食行为，还与蓟马的产卵选择、生长发育以及存活情况等密切相关。如西花蓟马对不同寄主花的嗅觉偏好性（玫瑰＞康乃馨＞非洲菊＞天竺葵）与害虫在田间的取食选择趋性表现一致[9]。西花蓟马和烟蓟马对紫花苜蓿的花表现极强的趋向性，葱和丝瓜花的挥发物对这两种蓟马也有较强的吸引作用，但这两种蓟马对罗勒和裂叶荆芥的花表现明显的忌避性，这种选择行为与两种蓟马在寄主上的种群数量趋势保持一致[13]。黄胸蓟马对寄主花的嗅觉反应为康乃馨＞郁金香Tulipagesneriana＞绣球Hydrangeamacrophylla＞玫瑰，蓟马从卵到成虫的发育历期在这4 种寄主上依次为9.58 d、9.92 d、10.35 d、10.75 d，存活率分别为76.33%、71.33%、64.00%和59.00%[27]。本试验表明牛角花齿蓟马对紫花苜蓿的花表现极强的正趋性，对草木樨、红豆草和红三叶无明显的行为选择趋性，这和田间观察的牛角花齿蓟马偏好在紫花苜蓿花上聚集程度高的现象一致。牛角花齿蓟马的这种嗅觉选择行为与其在不同寄主花上的产卵、生长发育及存活率等的关系还需进一步探究。

蓟马在嗅觉选择过程中，部分关键寄主挥发物组分发挥重要作用[17]。Cao 等[28]发现黄胸蓟马的偏嗜寄主栀子花释放的顺-3-己烯醇-2-甲基-2-丁烯酸酯、芳樟醇和（E3,E7）-4,8,12-三甲基-1,3,7,11-十三碳四烯对该蓟马有明显的引诱效果。豇豆Vignaunguiculata花对普通大蓟马Megalurothripsusitatus的引诱作用显著高于四季豆Phaseolusvulgaris花，豇豆花中的植醇和棕榈酸乙酯对普通大蓟马具有引诱活性，罗勒烯对普通大蓟马有显著的驱避效果[29]。目前，已报道对蓟马有引诱活性的植物挥发物有46 种，多为苯环类、萜烯类、吡啶类和酯类；表现驱避作用的有38 种，多为苯环类和萜烯类[30]。本试验中，苯甲醛是紫花苜蓿花挥发物的特有组分，研究表明10-4体积比浓度的苯甲醛对西花蓟马[31,32]和花蓟马[33]表现较强的引诱活性；草木樨花的特有组分β-石竹烯，10-4浓度对西花蓟马[11]和普通大蓟马[29]具有引诱作用；α-蒎烯作为紫花苜蓿和草木樨共有的特异组分，0.1 μg/mL 和1.0 μg/mL 浓度对棕榈蓟马具有很强的引诱效果[14]。月桂烯仅在红豆草花挥发物中鉴定到，月桂烯10-2浓度对西花蓟马[32]和花蓟马[33]具有显著的引诱效果。棕榈酸甲酯和百里酚是普遍存在于豆科牧草花中的挥发性组分，普通大蓟马[29]和烟蓟马[34]对这两种物质表现明显的忌避趋性。据此推测，苯甲醛、β-石竹烯、α-蒎烯、月桂烯对牛角花齿蓟马可能具有吸引作用，棕榈酸甲酯和百里酚对牛角花齿蓟马表现驱避作用。

本研究明确了牛角花齿蓟马偏好选择紫花苜蓿的花，对草木樨、红豆草和红三叶的花选择趋性较弱。4 种豆科牧草花释放的挥发物共鉴定到40 种化合物，其中紫花苜蓿32 种，草木樨24 种，红豆草和红三叶较少，分别有14 种和7 种，根据因子分析结果推测牛角花齿蓟马的嗅觉选择偏好与寄主挥发物的化学组成及含量密切相关。通常植食性昆虫对寄主的定位是通过多种挥发物组分形成的化学指纹图谱识别和判断[35,36]。因此，明确关键挥发物组分对牛角花齿蓟马的吸引或驱避作用的最佳浓度，探讨多种化合物的复配对蓟马行为反应的具体作用是后续研究的重要内容。这对阐明牛角花齿蓟马寄主选择的嗅觉感受机制，研发和应用植物源引诱剂进行害虫监测和防治具有重要意义。