贵州引种柑橘果实的可溶性糖组分与含量特征

林 乾, 李文云, 罗 怿, 王小柯, 柏自琴, 李金强

(贵州省果树科学研究所, 贵州 贵阳550006)

0 引言

【研究意义】果实品质是评价果品等级及优劣的重要依据,对果实市场竞争力起决定性作用[1],其中,可溶性糖在果实品质形成过程中发挥关键作用,是评价果实营养和感官特性的重要指标,其类型、含量及糖酸比共同决定果实甜度[2]。此外,可溶性糖是植物生长发育的重要贡献者,不仅为植物抵御逆境提供能量,还可作为反应物与免疫信号物质参与植物免疫[3],同时连接了蛋白质代谢、脂类代谢及核酸代谢[4],其代谢产物可调控细胞代谢,控制成花与果实成熟关键基因的表达[5]。因此,研究果实可溶性糖组分及含量差异对评价果实品质优劣及生态适应性具有重要参考意义。【前人研究进展】果实可溶性糖组分及含量除受品种遗传特性影响外,还受海拔、温度、水分、土壤、光照强度和栽培管理技术等多因素影响[6],造成不同品种间可溶性糖组成及含量存在差异,如适当高温有利于糖分的积累[7]、较大昼夜温差可促进柑橘果实蔗糖的增加[8]。陈慧琼等[9]利用高效液相色谱法(HPLC)检测64个黄皮种质资源果实可溶性糖的组成及含量表明,蔗糖是黄皮的主要可溶性糖。郑丽静等[10]采用离子色谱法(IC)检测132个苹果品种的成熟果实可溶性糖组分及含量表明,苹果的可溶性糖以果糖为主,其次是蔗糖和葡萄糖,山梨醇含量最低。此外,同一品种在不同产地可溶性糖也存在较大差异,如红美人果实的葡萄糖含量在衢州、宁波、宜昌等6个产地存在显著性差异,可溶性总糖含量最高的宁波比最低的宜昌高44.4%[11]。因此,受品种特性、自然条件和栽培技术等影响,不同产地果实可溶性糖组分和含量特征存在较大差异。【研究切入点】贵州省德江县是柑橘适生区,但该区域柑橘发展起步晚,品种结构有待优化。柑橘新品种引进是优化品种结构和培育优势区域的重要环节,而果实品质分析是新品种生态适应性评价的重要指标。【拟解决的关键问题】以贵州德江2017年引进的6个柑橘品种成熟果实为研究对象,通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测果肉可溶性糖,分析品种间可溶糖组分及含量特征,为柑橘品质评价、布局和结构调整提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为贵州德江引进的沃柑、大雅柑、纽荷尔脐橙、春见、晚熟8号血橙和濑户见6个柑橘品种成熟果实。2017年春季从重庆引入,砧木为香橙,当年定植于同一果园,栽培管理条件一致。果园海拔490 m,东经108.02°,北纬28.28°,年降水量1 200 mm,年均温16.8 ℃,无霜期310 d,土壤类型为黄壤。所采果实成熟度一致,除纽荷尔脐橙和晚熟8号血橙分别于2020年11月和2021年4月采集外,其余品种均采自2021年2月。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 醇、异丙醇、正己烷为分析纯,其中,甲醇、异丙醇购自德国Merck,正己烷购自上海安谱实验科技股份有限公司。99% BSTFA购自Aladdin,99%甲氧铵盐、99%吡啶购自Sigma-Aldrich。共13种标准品,其中,蔗糖、乳糖、葡萄糖、L-鼠李糖、木糖醇、D-阿拉伯糖购自上海安谱实验科技股份有限公司,麦芽糖、海藻糖、D-果糖、D-半乳糖、L-岩藻糖购自上海甄准生物科技有限公司,肌醇、D-山梨糖标准品购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

1.2.2 仪器 8890-5977B型气相色谱-质谱联用仪(Agilent)、5424R型离心机(Eppendorf)、CentriVap型冷冻干燥机(LABCONCO)、MM400型球磨仪(Retsch)、XD-DCY-24Y型氮吹仪(上海析达)、KQ5200E型超声清洗仪(昆山舒美)。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 每个品种随机选取3株树,在树冠中部东、南、西、北4个方位各采集果面光滑、无明显病虫斑、着色均匀、大小接近的成熟果实带回实验室。将各品种随机分成3组作为生物学重复,用蒸馏水洗净果面,取其果肉迅速于液氮中速冻后送武汉迈特维尔生物科技有限公司检测。供试样品真空冷冻干燥并研磨成粉末,每个样品称取20 mg进行萃取,萃取参照江海等[12-13]的方法,并稍有修改。称样后加入500 μL V甲醇∶V异丙醇∶V水(3∶3∶2)提取液,涡旋3 min并于冰水中超声30 min;4 ℃,14 000 r/min离心3 min,取50 μL上清液加入20 μL内标,氮吹并冻干;在所得冻干样中加入100 μL含15 mg/mL甲氧铵盐的吡啶,37 ℃孵育2 h,随后加入100 μL 衍生化试剂,37 ℃孵育30 min得衍生化溶液,用正己烷稀释待测。

1.3.2 气质联用分析 使用安捷伦8890-5977B气质联用仪,参照SUN等[14]的方法,并稍作调整。色谱条件:色谱柱为 DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和同型号保护柱;进样量为1 μL,按5∶1分流进样;载气为He,柱流速为1 mL/min。升温程序:170 ℃保持2 min后以10 ℃/min升至240 ℃,随即以5 ℃/min升至280 ℃,再以25 ℃/min升至310 ℃,保持4 min。质谱条件:传输线温度240 ℃,离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,电离电压70 eV。以13种可溶性糖混标梯度溶液作为质控样本,在检测分析过程中,每隔10个检测分析样本插入1个质控样本。

1.4 数据处理

根据标准品出峰时间和标准曲线分别对可溶性糖进行定性和定量分析。以外标与内标浓度比为横坐标,外标与内标峰面积比为纵坐标,绘制不同物质的标准曲线。将供试样品糖类的积分峰面积代入标准曲线方程按公式:计算得到样本中可溶性糖绝对含量。

样本中糖含量(mg/g)=c×V1×V2/V3/m/1 000 000

其中,c为样本中带入标准曲线得到的浓度值,V1为定容所用溶液的体积,V2为样本提取过程中加入样本提取液的体积,V3为样本提取过程中收集上清液的体积,m为称取的样本质量。

试验数据利用Microsoft Excel 2010处理,采用SPSS 22.0进行显著性分析、R软件(https://www.r-project.org/)进行相关性分析、Graphpad Prism 7.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 可溶性糖甲基化衍生物GC-MS分离

通过对同一质控样本质谱检测分析的总离子流色谱图进行重叠展示分析显示,总离子流图重叠性高,保留时间和峰强度均一致,说明检测期间仪器精密良好(图1)。衍生后的D-阿拉伯糖、木糖醇、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、D-山梨醇、肌醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖标准品浓度与其衍生物总离子流图积分峰面积的相关系数为0.996 1～0.999 6,均呈线性相关关系(表1)。

表1 13种可溶性糖标准曲线回归方程

图 1 可溶性糖标准品衍生物TIC图谱

2.2 不同品种可溶性糖组成及其相对含量

由图2可见,6个柑橘品种样品中均检测出7种可溶性糖,分别为肌醇(Inositol)、葡萄糖(Glu)、L-岩藻糖(Fuc)、D-果糖(Fru)、D-阿拉伯糖(Ara)、海藻糖(Tre)和蔗糖(Suc),未检测到木糖醇(Xylitol)、L-鼠李糖(Rha)、D-半乳糖(Gal)、D-山梨醇(Sorbitol)、乳糖(Lac)和麦芽糖(Mal)。品种间可溶性总糖为629.288 ～ 813.999 mg/g DW,大雅柑(DY)>春见(CJ)>濑户见(LHJ)>纽荷尔脐橙(NHE)>沃柑(WG)>晚熟8号血橙(XC)。6个品种均是蔗糖相对含量最高,变化范围较大(228.333～411.333 mg/g DW),相对含量为34.63%～53.87%,平均含量为318.278 mg/g DW,变异系数为19.55%;其次是D-果糖和葡萄糖,两者含量相近(169.667～219 mg/g DW,171～214.667 mg/g DW),变化范围较小,相对含量分别为22.22%～31.90%和22.48%～31.80%,平均含量分别为194.389 mg/g DW和191.278 mg/g DW,变异系数分别为9.69%和9.24%;再次是肌醇,相对含量为1.38%～2.10%,平均含量为12.756 mg/g DW,变异系数为14.30%;其余3种可溶性糖含量极低,均在0.1 mg/g DW以下,相对含量均不足0.08%(图2 B)。

图 2 6个柑橘品种样品中可溶性总糖(A)和各可溶性糖相对含量(B)

2.3 不同品种可溶性糖含量

对6个品种可溶性糖含量差异分析表明,不同品种可溶性糖含量存在较大差异,但均以蔗糖、D-果糖和葡萄糖为主要可溶性糖(图3)。大雅柑可溶性总糖含量最高,是最低晚熟8号血橙的1.296倍,且显著高于其他5个品种;品种间两两比较显示,可溶性总糖含量有11对达差异显著水平,有4对差异不显著(图3A)。蔗糖含量以春见最高,含量为411.333 mg/g DW,显著高于其他品种;除纽荷尔脐橙与晚熟8号血橙蔗糖含量差异不显著外,其余品种两两间蔗糖含量差异均达显著水平(图3B)。葡萄糖含量和D-果糖含量相近,均以大雅柑最高,分别为214.667 mg/g DW和219.000 mg/g DW,在6个品种间葡萄糖含量和D-果糖含量分别有12对、11对差异显著和3对、4对差异不显著(图3C～D)。肌醇、D-阿拉伯糖、海藻糖、L-岩藻糖含量均较低,4种糖含量在6个品种两两间分别存在13对、13对、14对、10对差异显著和2对、2对、1对、5对差异不显著(图3E～H)。

注：不同小写字母表示差异达显著(P<0.05)水平。

2.4 不同品种可溶性糖的相关性

对果实中各可溶性糖组分及可溶性糖总量进行相关性分析(图4)显示,相关性系数在0.5及以上的正相关有5对、负相关有3对,相关性系数在0.5以下的有20对,其中,有10对相关性系数小于0.1。蔗糖与可溶性总糖呈显著正相关关系,表明蔗糖是可溶性总糖的主要贡献者;D-果糖与葡萄糖呈极显著正相关关系,反映二者关系密切;海藻糖与可溶性总糖、蔗糖均呈显著负相关关系,说明海藻糖含量的升高不利于蔗糖含量的积累,二者存在一定的拮抗关系。其他可溶性糖间不存在显著相关性。

注：*和***分别表示在P<0.05和P<0.001水平上显著和极显著相关。

3 讨论

可溶性糖是影响果实风味的重要物质[15],水果中的可溶性糖主要以葡萄糖、果糖和蔗糖为主[16]。果树类型不同,果实可溶性糖组成及含量存在差异[17],如草莓以果糖和葡萄糖为主,少含或不含蔗糖[18];甜樱桃以葡萄糖为主[19];苹果和梨以果糖为主,含葡萄糖、蔗糖和山梨醇[10,20];桃、李和杏则以蔗糖为主要可溶性糖[21-23]。水果甜味不仅受可溶性糖种类的影响,还与其味感阈值有关。不同可溶性糖,其甜度不同,其中,果糖甜度最高,分别是蔗糖和葡萄糖的1.73倍和2.34倍[3],当可溶性糖含量/味感阈值>1时,该糖才对果实甜味产生影响[24],故部分可溶性糖的风味因其含量过低而无法被感知。此外,可溶性糖在口中停留的时间因种类不同而长短不一,蔗糖含量越高,越有利于形成口感好、风味浓的果实品质[10]。因此,不同可溶性糖组分和含量差异形成了果实特有的口感和风味。

对柑橘果实糖的研究主要集中在果糖、葡萄糖及蔗糖3种糖的组分差异及其代谢分析,对其他糖研究较少,利用GC-MS技术对6个柑橘品种果实进行糖组分检测,所建标准曲线相关性好、灵敏度高,检测数据可靠。对6个柑橘品种成熟果实可溶性糖组分分析表明,品种间可溶性糖含量存在较大差异,但6个品种均以蔗糖含量最高,平均含量为318.278 mg/g DW,属于蔗糖积累型,即蔗糖是甜度品质的重要贡献者,该结果与邓秀新等[25-26]研究报道一致;葡萄糖和果糖的平均含量分别为194.389 mg/g DW和191.278 mg/g DW,其比值约为1∶1,表现为显著正相关关系,该结论与孙达[27]研究报道一致。除上述3种主要可溶性糖外,其余4种平均含量均较低,其中,以肌醇平均含量最高,为12.756 mg/g DW,而D-阿拉伯糖、海藻糖、L-岩藻糖含量极低,平均含量均不足0.1 mg/g DW。但值得注意的是海藻糖与可溶性总糖、蔗糖均呈显著负相关关系,表明海藻糖的增多不利于果实可溶性糖的积累。

果实糖积累主要源自光合作用,以山梨醇和蔗糖的形式经韧皮部运输至果实,期间经复杂的代谢和转运,最终主要以葡萄糖、果糖和蔗糖的形式贮存在果实细胞[28]。在糖积累过程中,受品种遗传特性、果实生长发育、环境因子、栽培技术等诸多因素的影响,其中,糖代谢是调控果实糖积累的根本因素。糖代谢主要包括蔗糖代谢、山梨醇代谢和己糖代谢[28],不同代谢途径受一种至多种酶或信号分子调控,引起果实可溶性糖含量和组分存在较大差异,进而影响果实风味。不同品种间可溶性糖组分及含量差异可能是以上一种或多种因素共同作用的结果。

4 结论

贵州引种沃柑、大雅柑、纽荷尔脐橙、春见、晚熟8号血橙和濑户见6个柑橘品种共检测出蔗糖、葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、海藻糖、肌醇和L-岩藻糖7种可溶性糖,均以蔗糖含量最高(228.333～411.333 mg/g DW),其次是葡萄糖和D-果糖(169.667～214.667 mg/g DW),3种糖约占可溶性总糖的98%,品种间可溶性糖含量特征差异较大;D-果糖与葡萄糖、蔗糖与可溶性总糖呈显著正相关关系,海藻糖与蔗糖、可溶性总糖呈显著负相关关系。