基于COX2-PGE2途径探讨盆痛灵对气滞血瘀型EM大鼠的镇痛作用

李宣儒 夏 玉 王 丽 余思云 刘晓庆 付金荣

1.上海中医药大学龙华临床医学院，上海 200032；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011；3.上海中医药大学附属龙华医院妇科，上海 200032

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)是妇科常见的疑难杂症，在全世界育龄期妇女中占10%，是导致痛经和慢性盆腔疼痛的主要原因之一[1]。其反复发作的疼痛严重影响女性的身心健康，使部分患者出现抑郁焦虑倾向，故如何缓解患者的疼痛，提高患者生活质量已成为临床治疗EM的关键。课题组前期研究[2]证实盆痛灵可以缓解EM大鼠的疼痛，本研究在前期EM造模的基础上加入夹尾，建立病证结合的气滞血瘀型EM大鼠疼痛模型，以进一步探究盆痛灵对气滞血瘀型EM大鼠的镇痛作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 9周龄清洁级SD雌性大鼠，规格为(180±20)g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(浙)2019-0001，动物实验严格遵守上海中医药大学实验动物伦理委员会的要求(No.PZSHUTCM201106008)。

1.2 药物 盆痛灵颗粒剂(三棱，莪术，延胡索，川楝子，虎杖)，龙华医院中药房提供，符合质检标准。按成年人体重为50 kg计算，每日生药量为51 g，SD大鼠按人体每日用药量的6.25倍进行换算，故每日给药量为6.375 g·kg-1·d-1。

1.3 主要试剂和仪器 试剂：反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(批号：RR037A，TaKaRa公司)，荧光定量PCR试剂盒 TB Green®Premix Ex TaqTM(批号：RR420A，TaKaRa公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(批号：A0208，碧云天)，Cox2(D5H5)XP®Rabbit mAb#12282(批号：12282S，CST)，Trizol(批号：G8011-100mL，Adamas life)，大鼠前列腺素E2(PGE2)酶联免疫分析(批号：MM-0068R1，酶免)，大鼠雌二醇(E2)酶联免疫(批号：MM-0575R1，酶免)。仪器：VonFrey纤维丝(型号：NC12775-99，NorthCoast)，全自动血流变测试仪(型号：ZL9100C，北京众驰伟业科技发展有限公司)，PCR基因扩增仪(型号：PROFLEX，赛默飞)，实时荧光定量基因扩增仪(型号：7500，赛默飞)，低温高速离心机(型号：Centrifuge 5810 R，Eppendorf)，酶标仪(型号：Synergy H1，BioTek Instruments，Inc.)等。

1.4 分组、造模和给药方法 通过自体内膜种植法[3]对大鼠进行EM造模，取造模成功的30只大鼠，随机分成A组(EM造模1周后夹尾)，B组(EM造模不夹尾)和C组(EM造模1周后夹尾加中药盆痛灵干预)。另设假手术组(结扎后剪下单侧的一段子宫，不进行内膜种植)20只：随机抽取10只作为D组(假手术1周后夹尾)，剩余10只为E组(假手术不夹尾)。

在开腹造模1周后，大鼠腹部伤口基本愈合，开始对A组、C组和D组进行夹尾造模：用纱布包裹书夹(纱布是为了控制书夹力度，防止大鼠尾部皮肤受损)，夹住大鼠的尾部，大鼠被夹后情绪暴躁，会与其他大鼠发生打斗，此时可以把书夹松开，每次刺激30 min，每日2次，持续刺激3周[4]。

2周后各组大鼠进行二次开腹，EM模型大鼠内异灶向上凸起且内含透亮液体视为造模成功。夹尾造模的大鼠通过观察其行为学特征(舌紫，暴躁等气滞血瘀之象)，血液流变学(升高)和痛阈(变小)的变化判断其模型质量。

所有大鼠均采用直肠给药，A组、B组、D组、E组给予1 mL 0.9%生理盐水。C组给予盆痛灵，按照《药理实验方法学》[5]换算，剂量为每日6.375 g·kg-1(临床等效量)，配成1 mL药液。各组大鼠灌肠均每次1 mL，每日1次，持续4周。末次给药后，采集大鼠血液、腹腔液、子宫内膜组织。

2 检测指标及方法

2.1 痛阈测量 搭建老鼠足底触觉痛觉测试凿孔台，该设备分为凿孔台和鼠笼。大鼠放于鼠笼适应环境30 min，按照Dixon的“up&down”法，使用VonFrey纤维丝从2.0 g的力度开始刺激大鼠脚掌中部的皮肤，观察大鼠是否有缩足舔爪等躲避反应，并进行记录[6]。如大鼠无反应为阴性反应(记为“o”)，使用大一级的纤维丝继续刺激。大鼠出现缩足为阳性反应(记为“x”)，使用小一级力度的纤维继续刺激。当大鼠阴性反应和阳性反应(“ox”或“xo”)交替出现时，再连续往后测 4 次，得到一串以“o”和“x”组合而成的序列，以该序列和最后一根纤维丝的刺激力规格，计算得出痛阈。测量时间为各组大鼠造模前(术前痛阈，术D0)，以及二次开腹术后第 1天、第 3天、第 5天 、第 7天 、第14天、第21天和第28天(术D1、术D3、术D5、术D7、术D14、术D21、术D28)。

2.2 内异灶体积测量 游标卡尺测量内异灶的最大横径，和与之垂直的纵径，计算体积。

2.3 血液流变学检测 腹主动脉取血4 mL，放入肝素抗凝负压采血管中，采用全自动血流变测试仪检测凝血四项。

2.4 免疫组化检测子宫内膜组织中COX-2蛋白的表达 对大鼠子宫内膜组织进行包埋，切片，脱蜡复水，抗原修复，血清封闭。加一抗，湿盒 4 ℃ 孵育过夜。加二抗，湿盒37 ℃内孵育45 min。DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察及拍片，每张切片拍摄5个视野(x200)，使用Image-pro软件对COX-2蛋白进行积分光密度(IOD)的计算。

2.5 ELISA检测腹腔液中E2、PGE2的水平 取大鼠腹腔液，配置试剂备用。在待测样品孔中加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL。混匀，除空白孔外每孔加入酶标试剂100 μL，贴封板膜，37 ℃孵育60 min。弃去孔内液体，甩干，加洗涤液洗涤5次，拍干。每孔先加入显色剂A50 μL，再加入显色剂B50 μL，混匀，37 ℃避光显色15 min。加终止液50 μL，以空白孔调零，450 nm波长测量各孔的OD值。

2.6 RT-qPCR检测子宫内膜组织中COX-2mRNA的表达 50 mg大鼠组织加入 1 mL Trizol，冰上静置，加入氯仿，离心，加入等体积预冷的异丙醇，离心，加入等体积乙醇洗涤，离心，溶解于DEPC水中，以紫外分光光度计测其浓度和OD260/OD280、OD260/OD230。使用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit合成cDNA，β-actin作为内参，扩增引物由生工生物工程合成，引物序列见表1，使用荧光定量PCR试剂盒TB Green®Premix Ex TaqTM进行实时荧光定量PCR。每组设3个复孔，采用2-△△ct的方法计算其COX-2mRNA表达量。

3 结果

3.1 气滞血瘀型疼痛模型大鼠的行为学特征 A组与D组爪甲舌色瘀紫，耳缘发紫，尾部有暗紫色瘀斑，眼睛突出，暴躁易怒，攻击性强，易激惹[7]，体型偏瘦，食少，饮水多。C组用药后4周爪甲舌色呈粉红色，性情温和，体型圆润，B组与E组无明显特征。

3.2 大鼠不同时间段的痛阈变化 各组大鼠术D0痛阈无统计学差异(P>0.10)。E组术D0、术D7与术D28的痛阈无统计学差异(P>0.05)，可证明假手术造模和生理盐水灌肠对痛阈无影响。B组术D14痛阈小于E组(P<0.05)，可证明EM造模可降低大鼠痛阈，使大鼠的疼痛敏感度升高。D组术D14痛阈小于E组(P<0.05)，提示单纯夹尾也可以降低大鼠痛阈，提高大鼠疼痛敏感度。D组术D14痛阈大于B组(P<0.05)，说明EM造模降低痛阈的效果高于夹尾。A组术D14痛阈小于D组(P<0.01)与B组(P<0.05)，提示相较于单纯的夹尾或EM造模，夹尾联合EM造模降低大鼠痛阈的效果最好。A组术D28痛阈与术D14无统计学差异(P>0.50)，小于B组术D28(P<0.05)；D组术D28痛阈与术D14无统计学差异(P>0.05)，小于E组术D28(P<0.001)，术D28时夹尾造模已停止2周，痛阈仍持续下降，说明该造模具有持续性。C组术D28大于A组术D28(P<0.001)，提示盆痛灵可治疗气滞血瘀型EM。见表2。

表2 大鼠不同时间段的痛阈变化

如图1，E组和C组在术后先下降，后逐渐上升，高于其他3组。D组在术后先下降，后缓慢上升，又在气滞血瘀的造模过程中下降。A组和B组术后基本呈下降趋势，前者整体较后者更低。

图1 大鼠不同时间段的痛阈变化

3.3 盆痛灵对大鼠异位灶体积的影响 如表3，A组、B组在二次开腹时的异位灶体积小于其取材时(P<0.01)，提示此两组异位灶体积随着时间变化逐渐增大，生理盐水灌肠无治疗作用。C组在二次开腹时的异位灶体积大于其取材时(P<0.001)，小于A组取材时(P<0.001)，提示盆痛灵可缩小异位灶体积。

表3 二次开腹和取材时大鼠异位灶体积变化

3.4 大鼠血液流变学变化 如表4，B组全血黏度低、中、高切大于E组(P<0.05)，提示大鼠经EM造模后血液黏度变高。A组全血黏度低切大于B组(P<0.05)，D组全血黏度低、中切大于E组(P<0.05)，提示大鼠经过夹尾造模后，红细胞聚集性变高，血液黏度变高。D组全血黏度低、中、高切小于A组(P<0.05)，与B组无统计学差异(P>0.05)，提示夹尾联合EM造模相较于单纯的EM造模或夹尾，可以进一步提高大鼠血液黏度。C组全血黏度低、中、高切小于A组(P<0.05)，全血黏度低、中、高切和血浆黏度均与E组无统计学差异(P>0.10)，提示盆痛灵可以改善气滞血瘀型EM大鼠的血液黏滞程度。

表4 大鼠血液流变

3.5 免疫组化检测大鼠子宫内膜组织中COX-2蛋白的表达 COX-2主要在大鼠异位子宫内膜组织的腺上皮细胞与间质细胞的胞浆中进行表达，在正常子宫内膜上表达较弱。它在A组表达最为明显，B组其次，在D组的阳性表达较前两者减弱，在C组和E组里基本无明显阳性表达，如图2所示。

图2 大鼠子宫内膜组织中COX-2蛋白的表达(免疫组化，×200)

如表5，A组的COX-2蛋白表达高于B组(P<0.05)，D组高于E组(P<0.01)，提示经过夹尾造模后，大鼠子宫内膜组织中COX-2蛋白的表达水平升高。C组和E组无统计学差异(P>0.05)，低于A组(P<0.001)，提示盆痛灵可以降低COX-2蛋白表达水平。

3.6 ELISA检测大鼠腹腔液中E2，PGE2的水平 如表6与表7，A组高于B组(E2：P<0.001；PGE2：P<0.01)，D组高于E组(P<0.001)，提示经过夹尾造模后，大鼠E2，PGE2水平增高。C组和E组无统计学差异(E2：P>0.05；PGE2：P>0.5)，低于A组(P<0.001)，提示盆痛灵可降低气滞血瘀型EM大鼠的E2，PGE2水平。

表5 大鼠子宫内膜组织中COX-2蛋白的表达

表6 大鼠腹腔液的E2水平

表7 大鼠腹腔液的PGE2水平

3.7 RT-qPCR检测大鼠子宫内膜组织中COX-2mRNA的表达 见表8，A组的COX-2 mRNA大于B组(P<0.001)，D组的COX-2 mRNA高于E组(P<0.01)，提示经过夹尾造模后，大鼠COX-2 mRNA表达升高。C组与E组无统计学差异(P>0.05)，低于A组(P<0.01)，证明盆痛灵可降低气滞血瘀型EM大鼠COX-2 mRNA表达水平。

表8 大鼠子宫内膜组织中COX-2mRNA的表达

3.8 各检测指标与痛阈的相关性分析 见表9，COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表达水平与痛阈之间均存在显著相关及负相关关系，表明COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表达水平越高，大鼠痛阈越低，疼痛越严重。

表9 各检测指标与痛阈的相关性分析

4 讨论

目前临床上尚无能彻底治愈EM的药物，故人们一直致力于新药物的研发。疼痛是EM最主要的症状，构建符合EM临床发病特点的动物模型是药物研发的基础，所以创建理想的EM疼痛动物模型是值得关注的问题。

当前EM模型多着重于EM疾病本身，尚未见有针对EM疼痛的模型报道。课题组前期研究[2]已证实通过自体内膜移植可成功建造EM模型大鼠。本研究在前期研究基础上首次加入夹尾，建立病证结合的气滞血瘀型EM大鼠疼痛模型，通过机械测痛，检测血液流变和观察行为学特征对该模型质量进行评价。该疼痛模型在西医理论复制疾病模型的基础上，运用中医理论构建证候模型的方法加重大鼠疼痛度，旨在为EM疼痛防治研究提供稳定性高，重复性好且与临床实际更吻合的动物模型。

本研究中，夹尾后的大鼠爪、甲、舌、耳，尾部的颜色发紫，且伴有眼突，暴躁易激，是持续疼痛导致的气滞血瘀之象；比较各组痛阈，与单纯夹尾或EM造模相比，夹尾联合EM造模的大鼠痛阈最低，说明夹尾作为一种辅助手段，联合EM造模可最大程度降低大鼠痛阈，增高其痛觉敏感度；比较各组血液流变学，夹尾联合EM造模的大鼠全血黏度上升程度最高，提示大鼠红细胞聚集性变高，红细胞积聚形成血瘀，使血液黏度变高[9]，符合气滞血瘀状态。该模型夹尾造模结束于术D14，血液流变水平和痛阈(术D28)的结果均是在夹尾造模停止2周后测得的，说明其气滞血瘀状态具有持续性，不会随物理刺激的停止而消失，故具有一定推广性。

有研究证实，COX-2与PGE2在EM中与疼痛呈正相关。COX-2通过生成PGE2，参与炎症反应，加重EM的疼痛[10-11]。PGE2升高可加速E2的合成[12]，E2可介导ERβ上调COX-2表达，而COX-2又刺激炎性介质PGE2产生[13-14]，三者相互作用，使EM患者感到疼痛。

观察各组COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2表达水平及各指标与痛阈的相关性分析可发现：夹尾后大鼠各项指标表达皆有上升，痛阈变低，疼痛程度加重，其中夹尾联合EM造模的大鼠各指标表达水平最高，痛阈最低。使用盆痛灵治疗后，大鼠各项指标表达皆下降，痛阈变高，疼痛得到缓解。

盆痛灵方由三棱、莪术、虎杖、延胡索和川楝子组成，具活血行气、祛湿止痛之功[15-16]。前期研究[17]表明盆痛灵可缓解EM盆腔疼痛，本实验大鼠治疗后，爪甲舌色呈粉红，性温体圆；血液流变水平下降；内异灶缩小；痛阈升高，大鼠疼痛得到缓解，盆痛灵方的作用机理可能是通过COX2-PGE2信号通路，抑制PGE2的表达水平，从而起到镇痛作用。