丹荷颗粒对高胆固醇血症大鼠肝脏超微结构及SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表达的影响

于彤，张珊，乔艳芳，刘素素，杨双杰，俞德帅，于雪，薛晓琳，柴欣楼，王伟

北京中医药大学，北京 100029

高胆固醇血症是以血液中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平显著升高为主要表现的一种疾病，是我国血脂异常患者临床主要分型之一。《中国血脂管理指南（2023年）》显示，近年来血脂异常总体发病率逐年上升，其中以高胆固醇血症最为明显[1]。当血液中胆固醇含量异常升高，长期不受控制时，会诱发动脉粥样硬化，进而导致严重的心血管事件，有效防治高胆固醇血症是预防心血管疾病的重要措施[2]。

肝脏是脂质代谢的重要器官，肝细胞对脂质具有储存和分泌作用。肝细胞中存在多个调节脂质代谢的关键靶点，其中肝X受体α（LXRα）是核受体超家族成员，通过与视黄醇X受体α（RXRA）结合形成异二聚体影响胆固醇和脂质代谢[3]。固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）是一种重要的核转录因子，在脂质合成基因的调控中有重要作用[4]。

丹荷颗粒来源于名老中医郭维琴的经验方丹荷汤，由丹参、荷叶、虎杖、薏苡仁、陈皮、山楂组成，具有活血消食、祛湿健脾功效。药物成分测定发现，方中含有丹参素、虎杖苷、白藜芦醇等多种有效成分[5-6]。其中丹参素可以减少脂肪酸和内源性胆固醇合成，加速脂肪酸氧化分解[7]；虎杖苷可抑制胆固醇代谢相关基因，促进胆固醇外排[8]；白藜芦醇能抑制Akt蛋白表达及其磷酸化，下调mTOR蛋白表达，减少肝细胞内脂质堆积[9]。课题组前期研究发现，丹荷颗粒具有良好的调节血脂作用，可以降低高脂血症大鼠血清TC 和LDL-C含量，其机制与抑制小肠胆固醇吸收、促进小肠胆固醇排出有关[10]，然而其对肝脏脂质代谢的影响及作用机制尚不清楚。本研究观察丹荷颗粒对高胆固醇血症模型大鼠肝脏内脂质沉积及相关蛋白表达的影响，探讨其保护肝脏的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级8 周龄健康雄性SD 大鼠36 只，体质量180～200 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0008。饲养于北京中医药大学动物实验中心，温度（25±2）℃，湿度（50±10）%，12 h/12 h昼夜循环，自由饮水摄食。本实验通过北京中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（BUCM-4-2021040106-2119）。

1.2 药物及制备

丹荷颗粒由丹参、荷叶、虎杖、薏苡仁、净山楂、陈皮按1∶1.5∶1∶3∶1∶1比例组成。颗粒剂由北京中医药大学中药学院提供，使用热纯净水溶解，待恢复常温后使用。阿托伐他汀钙片，批号1C2354DL3，齐鲁制药有限公司，10 mg/片，将药片研碎后，用纯净水溶解，配制成0.21 mg/mL溶液。

1.3 试剂与仪器

通用型组织细胞固定液、油红O染液、苏木素染液、电镜固定液（货号分别为G1101、G1015、G1004、G1102，武汉赛维尔），SREBP-1抗体（货号ab28481，英国Abcam），LXRα 抗体（货号CY6866，上海Abways），RXRA抗体（货号21218-1-AP，美国Proteintech），β-actin 抗 体（货 号AB2001，上 海Abways）。 电 子 天 平（ 型 号BSA224S， 德 国Sartorius），全自动生化分析仪（型号120，日本东芝），高速离心机（型号D-37520，德国Sigma），酶标仪（型号Bio-RadiMark，美国伯乐），超分辨显微组织成像仪（型号A009，德国Leica），冰冻切片机（型号HM43，美国赛默飞），电泳仪（型号PowerPaTM，美国伯乐），凝胶成像仪（型号5200，上海天能）。

1.4 分组、造模及给药

36只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药组和丹荷高、中、低剂量组，每组6只，除空白对照组外，其余各组均予2 mL/100 g高脂乳剂（含猪油30 g、胆固醇5 g、蛋黄粉5 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、吐温80 4 mL，用蒸馏水定容至100 mL，充分搅拌而成）灌胃，同时更换潮湿垫料饲养建立高胆固醇血症模型，空白对照组用正常垫料饲养并予等体积纯净水灌胃，1次/d，连续12周。第6周末眼眶取血检测各组大鼠血脂，造模大鼠TC、LDL-C含量显著高于空白对照组（P＜0.05），提示高胆固醇血症造模成功。第7周开始，各给药组造模同时予相应药物灌胃，按人与大鼠等效剂量计算给药剂量，丹荷高、中、低剂量组予丹荷颗粒溶液3.30、1.10、0.37 g/kg灌胃，阳性药组予阿托伐他汀溶液2.1 mg/kg灌胃，灌胃体积10 mL/kg。空白对照组和模型组予等体积纯净水，连续6周。

1.5 指标检测

1.5.1 肝重比

末次给药后大鼠禁食不禁水24 h，称量体质量，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，剖腹，分离肝脏，称量肝脏质量，计算肝重比（肝脏质量/体质量）。

1.5.2 血脂及肝功能检测

大鼠称重后腹主动脉采血，室温静置2 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离血清，全自动生化分析仪检测血清TC、三酰甘油（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）含量。

1.5.3 油红O染色

取新鲜肝组织，冷冻后制备冰冻切片，固定，油红O染色，分化后进行苏木素染色，封片，显微镜下观察。用Image J图像分析软件计算染色面积比（染色面积÷区域面积×100%）。

1.5.4 透射电镜观察

剪取肝组织1 cm3，置于4 ℃预冷电镜固定液中，分别进行后固定、脱水、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射电镜下扫描并拍照。

1.5.5 Western blot检测

取大鼠肝组织，提取蛋白后，BCA法进行蛋白定量。加热使蛋白变性，电泳、转膜后，常温封闭2 h，加SREBP-1、LXRα、RXRA一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加二抗，常温孵育1 h，ECL法曝光，凝胶成像仪成像，用Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白与内参（β-actin）灰度值比值。

1.6 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，符合正态分布采用方差分析，方差齐两两比较用LSD-t检验，方差不齐用Tamhane T2检验；不符合正态分布用非参数检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹荷颗粒对模型大鼠肝重比的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠体质量显著减少，肝重比显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠体质量均显著增加，肝重比显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠体质量和肝重比比较（±s，每组6只）

2.2 丹荷颗粒对模型大鼠血脂及肝功能的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C、ALT含量均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C含量显著降低（P＜0.01），丹荷各剂量组血清ALT含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），丹荷高、低剂量组血清TG含量显著升高（P＜0.05）。各组大鼠血清AST含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血脂及肝功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠血脂及肝功能指标比较（±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

AST/（U/L）171.60±14.32 172.60±42.68 155.50±50.99 187.70±51.11 173.70±48.50 177.40±25.15组别空白对照组模型组丹荷高剂量组丹荷中剂量组丹荷低剂量组阳性药组只数6 6 6 6 6 6 TC/（mmol/L）1.35±0.05 2.78±0.40##1.29±0.11**1.36±0.20**1.65±0.30**1.39±0.24**LDL-C/（mmol/L）0.14±0.03 0.36±0.16##0.12±0.02**0.13±0.03**0.15±0.04**0.14±0.03**TG/（mmol/L）0.31±0.05 0.35±0.05 0.60±0.12*0.52±0.09 0.61±0.11*0.33±0.08 HDL-C/（mmol/L）1.10±0.04 1.95±0.22##0.97±0.08**1.04±0.14**1.24±0.19**1.08±0.18**ALT/（U/L）38.43± 3.51 56.43±15.13#36.57± 2.64*33.00± 4.40**34.14± 4.60**40.57± 5.06

2.3 丹荷颗粒对模型大鼠肝组织脂质沉积的影响

空白对照组大鼠肝细胞排列有序，肝索规整。与空白对照组比较，模型组大鼠肝细胞排列紊乱，可见明显脂肪空泡，肝组织油红O 染色面积比显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肝细胞排列相对整齐，脂肪空泡减少，肝组织油红O染色面积比显著减少（P＜0.05，P＜0.01），其中丹荷高、中、低剂量组差异更显著（P＜0.01）。见图2、图3。

图2 各组大鼠肝组织形态（油红O染色）

图3 各组大鼠肝组织脂质沉积比较（±s，每组6只）

2.4 丹荷颗粒对模型大鼠肝组织超微结构的影响

空白对照组大鼠肝细胞形态正常，胞质内可见极少量脂滴，细胞核大小适中、核膜完整，线粒体广泛分布在胞质内、形态完整，周围有大量内质网，核糖体丰富；与空白对照组比较，模型组大鼠肝细胞内脂滴数量剧增，且大小不一，细胞核固缩、核膜边界挤压变形，线粒体形状发生改变、边界不清晰，周围内质网数量减少，核糖体存在脱颗粒现象；与模型组比较，丹荷高剂量组大鼠肝细胞边缘有脂滴分布，脂滴数量较少，细胞核较大、居中、核膜边界完整，线粒体形态相对完整、边界较清晰，内质网数量较多、结构清晰，核糖体较明显。见图4。

图4 各组大鼠肝组织超微结构

2.5 丹荷颗粒对模型大鼠肝组织固醇调节元件结合蛋白1、肝X受体α、视黄醇X受体蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，丹荷高剂量组大鼠肝组织SREBP-1、LXRα、RXRA 蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图5。

图5 各组大鼠肝组织SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表达比较（±s，每组3只）

3 讨论

《灵枢·卫气失常》有“膏者，多气而皮纵缓，故能纵腹垂腴。肉者，身体容大，脂者，其身收小”，《素问·通评虚实论篇》有“凡治消瘅、仆击、偏枯、痿厥，气满、发逆，肥贵人则高粱之疾也”，对“脂”“膏”等病理特点的描述为现代医家提供了理论基础。目前，临床多将本病归因于脾[11]。脾失健运，营养精微不得输布，脂膏运化失常，气血运行不畅，故脾虚气郁血瘀，体内脂膏累积发为本病。治以健脾理气、活血化瘀。丹荷颗粒方中荷叶升发清阳之气，丹参活血祛瘀，二者共为君药；薏苡仁健脾利水，虎杖归肝经，亦可解毒散瘀，二者共为臣药；佐以山楂、陈皮理气健脾。全方以平和、缓消的治法健脾理气、散瘀活血，从而推动气血津液等精微物质运行，减少脂膏积蓄，发挥降脂作用。

从微观层面上来看，脂膏属于脂质代谢的范畴。肝脏是脂质代谢的主要场所，调节肝脏脂质代谢对高胆固醇血症的治疗有重要作用。研究显示，SREBPs和LXRs 2种转录因子可以感知肝细胞内的胆固醇水平，二者既可以作为独立途径发挥作用，又可以在特定条件下相互影响[12]。SREBPs是脂质代谢的关键靶点，主要存在于内质网中[13]，其重要表型SREBP-1 又分为SREBP-1a、SREBP-1c，对胆固醇与脂肪酸合成、胆固醇酯化等过程都具有调控作用[14-15]。SREBPs在细胞内的加工过程较为复杂，SREBP 裂解激活蛋白与SREBP前体蛋白结合形成复合物，将SREBP运输到高尔基体，再经水解酶剪切进入细胞核，从而与目标基因结合[16]。通常情况下，细胞内胆固醇浓度低时，SREBP-1a被激活，直接调控胆固醇、脂肪酸合成基因；而胆固醇浓度较高时，SREBP-1a进入高尔基体过程受阻，不能与细胞核内脂质合成基因结合，从而避免脂质积累造成脂毒性，稳定细胞内脂质水平[13]。研究表明，长期高脂喂养和持续高浓度胆固醇刺激会使SREBP-1蛋白表达异常升高，造成机体内胆固醇和脂肪酸双重积累[17-18]。LXRs是核受体家族的一员，在胆固醇代谢中，LXRα的调控功能主要作用在胆固醇向胆汁酸分解、多余胆固醇流出、胆固醇酯化等方面[19]。RXRs是核受体家族的中心分子，可以调节细胞新陈代谢过程[20]，其生理功能主要依赖于与之结合的受体。RXRA与LXRα结合形成异二聚体是LXRα激活的基础[21]。在胆固醇浓度较高时，LXRα/RXRA收到胆固醇升高的信号进而激活，直接增加下游SREBP-1c表达，激活下游脂肪酸合成基因转录，造成大量脂肪酸生成。多余的脂肪酸一部分为胆固醇酯化提供底物，同时聚集形成脂滴，促使肝脏脂肪变性。此外，LXRs与SREBPs 的相互作用还表现在胆固醇合成方面，LXRs 激活可能诱导泛素连接酶抑制SREBPs 的另一表型SREBP-2 的成熟过程[19，22]，从而抑制胆固醇合成。

本研究发现，丹荷颗粒可降低高胆固醇血症大鼠肝重比及血清TC、LDL-C、ALT含量，恢复肝细胞结构，说明丹荷颗粒可以缓解肝脏代谢负荷，对肝脏具有一定保护作用。本实验在高脂乳剂中添加丙硫氧嘧啶，可提升高胆固醇血症造模速度和幅度，是高脂研究常用工具药，多用于治疗甲状腺功能亢进症，长期服用可导致甲状腺功能减退，从而使血液中TC含量升高。郝维佳等[23]发现，加入丙硫氧嘧啶可使大鼠血液TC和LDL-C含量升高，同时HDL-C异常升高，而TG无明显变化。课题组前期实验发现，丹荷颗粒对甲状腺激素恢复有一定调节作用，故推测给药后TG、HDL-C含量改变是因甲状腺激素变化而发生，后续将增加丙硫氧嘧啶对照组进行进一步观察。在高胆固醇血症研究中，血清TC、LDL-C及油红O染色是极具代表意义的指标，丹荷高剂量组在关键指标的评价中作用显著（P＜0.01），因此后续在微观结构观察及降脂分子机制的初步探讨中选取高剂量组进行评价。结果显示，模型组大鼠肝细胞内脂质沉积明显，线粒体形态改变，内质网数量减少，肝组织SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表达显著升高，丹荷高剂量组大鼠肝细胞脂质沉积减少，线粒体形态相对完整、边界较清晰，内质网数量增加，肝组织SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表达显著降低。表明丹荷颗粒可能通过下调肝组织SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表达，抑制肝脏胆固醇合成，减少脂质沉积。课题组后续将对SREBP-1 与LXRα/RXRA的上下游关系进行深入研究，为中药防治高胆固醇血症提供更丰富的研究基础。