“峨眉伤科膀胱经推拿”对LIDD模型白兔神经及血管内皮生长因子的影响❋

蒋雨晴,赵小艳,姜建振,叶江南,张 鑫,李文翰,卢群文,朱 俊,苏程果△

(1.成都中医药大学针灸推拿学院,成都 610075;2.成都中医药大学临床医学院,成都 610075;3.黄冈市中心医院,湖北黄冈 438000)

腰椎间盘退行性病变(lumbar intervertebral disc degeneration,LIDD)是指腰椎间盘等组织结构老化、退变,从而发生的一系列病变,包括腰椎间盘突出症、退行性腰椎滑脱症、椎间盘源性腰痛等疾病,而椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是其最重要的病理基础,严重危害人类健康、降低患者的生活质量[1-3]。研究证实,推拿在防治LIDD方面发挥着极其重要的作用,能有效延缓IDD进程,具有安全性高、疗效确切的双重优势[4-5]。

课题组前期研究证实,“峨眉伤科膀胱经推拿”能延缓IDD白兔椎间盘(intervertebral disc,IVD)的退变,具体机制与调控IVD中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein, Beclin-1)、自噬蛋白微管相关蛋白轻链(autophagy proteins microtubule-associated protein light chain,LC)3、白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的表达有关[6-7]。研究表明,神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在IDD病情进展过程中发挥重要作用[8-12]。因此,本研究以LIDD模型白兔为载体,从神经和血管内皮生长因子角度探讨“峨眉伤科膀胱经推拿”对LIDD的作用机制。研究已通过成都中医药大学实验动物伦理委员会批准,编号:2021-23。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级4月龄健康雄性新西兰大白兔15只,体质量(2.5±0.2)kg,由成都中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(苏)2017-0002。于笼中适应性饲养1周,予自由进食、饮水,标准光照周期(12 h光照/12 h黑暗),室内温度20～26 ℃,湿度50%～70%。

1.2 主要试剂及仪器

青霉素钾(货号140051251),江西省科达动物药业有限公司;神经肽(neuropeptide,NP)Y ELISA试剂盒(货号MM-8270402)、血浆P物质(substance P,SP)ELISA试剂盒(货号MM-020402)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)ELISA试剂盒(货号MM-8253702)、5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)ELISA试剂盒(货号MM-3720302),江苏酶联免疫分析工业有限公司;NGF蛋白一抗(货号DF6061)、Trk(tyrosine kinase receptor,Trk)A蛋白一抗(货号DF6822),美国Affinity公司;VEGF蛋白一抗(货号GB11034B)、VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)1蛋白一抗(货号GB13554)、VEGFR2蛋白一抗(货号GB11190),美国Servicebio公司。

JJ-12J型脱水机、JB-P5型包埋机、JB-L5型冻台,武汉俊杰电子有限公司;RM2016型石蜡切片机,上海徕卡仪器有限公司;D3024型离心机,美国赛洛捷克SCILOGEX公司;SLAN-96S型全自动医用PCR分析系统,上海宏石医疗科技有限公司;ChemiScope 6100化学发光成像系统,上海勤翔科学仪器有限公司。

1.3 分组与造模

采用随机数字表法将白兔分为对照组、模型组和推拿组3组,每组5只。模型组和推拿组动物采用经腹膜后间隙穿刺纤维环的方法建立LIDD白兔模型[13]。使用穿刺针对L2～L3、L3～L4、L4～L5进行IVD穿刺。对照组不穿刺IVD,其余操作同模型组。术后处理:穿刺部位消毒包扎,肌肉注射青霉素钾,4×105U/只,1次/d,共5 d。参照病理评分标准进行模型评价:干预结束后处死取材,比较对照组与模型组IVD组织HE染色病理评分,若模型组相较于对照组显著升高(P<0.05),提示造模成功[14]。

1.4 治疗方法

完成造模5 d后开始干预。推拿组白兔参考“峨眉伤科膀胱经推拿法”进行推拿干预,参考《兽医针灸学》及《实验针灸学》进行穴位定位[15-17]。具体操作方法如下:1)按揉法:自上而下按揉腰背部双侧竖脊肌,重点是脊柱两侧膀胱经,侧重L2～L5部位,操作480次,共4 min;2)点按法:采用近部取穴原则,点按双侧膀胱经的肾俞、三焦俞、脾俞,操作30次,共3 min;3)弹拨法:顺膀胱经弹拨脊柱两侧竖脊肌,操作450次,共3 min。为了避免推拿治疗过程中由于手法熟练程度、取穴准确性、节奏频率以及力度大小等差异所引起的误差,推拿手法干预均由同一位熟练掌握峨眉伤科流派手法的资深医师经过标准操作程序培训后实施操作。每周一至周五固定时段进行推拿干预治疗,每次10 min,每周5次,共计4周。对照组和模型组白兔仅抓取固定,不予其他任何干预。

1.5 标本制备

推拿干预4周后,所有白兔采用3%浓度戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉,取腹主动脉血备用[18]。随后采用耳缘静脉空气栓塞法处死后取出L2～L3、L3～L4和L4～L5的IVD,其中L2～L3的IVD放入4%多聚甲醛固定,剩余IVD和血液样本于-80 ℃冷冻保存。

1.6 指标检测

1.6.1 HE染色 将IVD样本使用4%多聚甲醛固定后,脱钙、脱水,石蜡包埋,3 μm连续切片,苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色后封片,在光学显微镜下(×100)观察IVD组织退变情况。随后,参照IVD组织病理学分级量表进行HE染色评分,量表中将IVD分为纤维环、髓核和纤维环边界、髓核细胞数、髓核基质4类,每类按照1～3分级记1、2、3分。总分4分为正常,12分代表严重退变[14]。

1.6.2 ELISA检测 将白兔血液样本离心后取上清液。按照ELISA试剂盒说明书检测血清中NPY、SP、CGRP、5-HT的表达。通过酶标仪进行光密度(optical density,OD)测定,再代入方程计算样品浓度。

1.6.3 荧光定量PCR检测 将IVD组织匀浆后提取总RNA,使用核酸分析仪检测RNA浓度及纯度,使其终浓度为500 ng/μL。反转录后配置荧光定量PCR反应体系测定RNA表达情况。数据采用2-△△Ct法进行分析。GAPDH、NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1和VEGFR2的引物序列见表1。

1.6.4 Western blot检测 将 IVD组织提取总蛋白,蛋白定量,电泳,转膜,加入稀释好的一抗NGF(1:1 000)、TrkA(1:500)、VEGF(1:1 000)、VEGFR1(1:1 000)、VEGFR2(1:1 000),孵育过夜后再加入相应二抗,超敏增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂显影,在化学发光成像系统下采集图像并进行灰度分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组白兔椎间盘组织HE染色结果比较

HE染色结果显示(图1),对照组IVD组织内髓核与纤维环界限清晰、连接紧密无中断,髓核形状规则,髓核内细胞丰富且分布均匀,凝胶状结构中含有大液泡,髓核基质呈正常凝胶状表现,纤维环排列整齐无破裂,呈同心圆状。模型组与对照组比较,可见IVD组织内髓核与纤维环互相分离且有中断,髓核形状不规则,髓核细胞数量和液泡显著减少,髓核基质呈中重度凝结状态。推拿组IVD组织内髓核与纤维环连接较紧密有轻度中断,髓核形状较规则,髓核细胞数量略有减少、液泡较少,髓核基质呈轻微凝结状态。

图1 各组白兔椎间盘组织HE染色结果(×100)

HE染色结果评分显示(表2),与对照组比较,模型组IVD组织HE染色评分显著升高(P<0.01),提示造模成功;与模型组比较,推拿组IVD组织HE染色评分显著降低(P<0.05)

表2 各组白兔椎间盘组织HE染色结果评分比较(分,

2.2 各组白兔血清NPY、SP、CGRP、5-HT水平比较

如表3所示,与对照组比较,模型组血清NPY、SP、CGRP、5-HT表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,推拿组血清NPY、SP、CGRP、5-HT表达显著降低(P<0.05)。

表3 各组白兔血清NPY、SP、CGRP、5-HT水平比较

2.3 各组白兔椎间盘组织NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达比较

如表4所示,与对照组比较,模型组IVD组织中NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,推拿组IVD组织中NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA表达水平显著降低(P<0.01),TrkA mRNA水平差异无统计学意义。

表4 各组白兔椎间盘组织中NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达水平比较

2.4 各组白兔椎间盘组织NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2 蛋白表达比较

如图2和表5所示,与对照组比较,模型组IVD组织中NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,推拿组IVD组织中NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达显著降低(P<0.05)。各组TrkA蛋白表达比较差异无统计学意义。

注:神经生长因子(NGF);酪氨酸激酶受体A(TrkA);血管内皮生长因子(VEGF);血管内皮生长因子受体1(VEGFR1);血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)

表5 各组白兔椎间盘组织NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表达比较

3 讨论

LIDD属中医学“痹证”“腰痛”等范畴,其主要症状为腰痛,可伴下肢活动受限[19-20]。“峨眉伤科流派”认为腰痛者肾虚为其根本,外邪引动致气血失和,水湿不利,经脉痹阻。因此,该流派主张采用按揉法和弹拨法作用于腰背部足太阳膀胱经,以行气和血,松解粘连、理顺经筋,通经止痛;点按肾俞、三焦俞、脾俞以固肾、利水、强腰。现代研究证实,按揉和点按椎间盘突出症大鼠腰背部具有镇痛消炎、改善局部血液循环的作用,弹拨脊柱两侧竖脊肌可以改善腰椎小关节紊乱及神经根受压的情况,促进骨与肌肉动力平衡,在多种手法的共同作用下能有效延缓LIDD发展进程[21-23]。

健康的IVD没有血管组织,而Freemont等[24-25]发现在纤维环破裂的腰椎间盘中,纤维环裂隙和椎间盘髓核内存在血管肉芽组织,神经纤维又可沿着血管肉芽组织区域向IVD纤维内层甚至是髓核内生长,且退变的IVD中NGF和TrkA的表达水平较高。NGF在神经系统的发育和组织疼痛方面有重要作用,可促进神经轴突生长,从而加重IVD神经浸润现象[26-27]。VEGF通过结合并激活受体酪氨酸激酶VEGFR1和VEGFR2来介导血管的新生,使退变的IVD内出现血管化现象[28]。TrkA是NGF的高特异性亲和力受体,结合后可刺激NPY、SP、CGRP、5-HT的释放,引起中枢和外周敏化,在调节炎性疼痛中起到关键作用[29]。研究证实,IDD患者血清中NPY、SP、CGRP、5-HT的表达升高是椎间盘源性疼痛的重要原因[30-31]。本研究结果显示,模型组白兔IVD组织中NGF、TrkA、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的mRNA和NGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白含量显著上升,并且血清中NPY、SP、CGRP、5-HT含量增加,提示退变的IVD组织中有大量血管和神经生长因子聚集,有新生血管形成和神经浸润现象。

马惠昇[32]发现推拿手法可刺激皮肤表面的感受器,反射性兴奋血管运动中枢,促使毛细血管扩张、增强血管壁的弹性,加快血液循环,达到“化瘀”的作用。刘家远等[33]采用循经点穴推拿治疗腰椎间盘突出症患者,发现患者炎症反应减轻,血浆NGF水平显著下降,受损神经得到修复。裘兴栋等[34]发现穴位刺激能通过下调软骨终板中VEGF、IL-1β表达水平,增加软骨终板内血管芽数目、降低钙化层厚度,从而发挥延缓颈椎间盘退变的作用。本实验显示,推拿组白兔IVD组织中NGF、VEGF及受体VEGFR1、VEGFR2的mRNA和蛋白表达显著减少,提示“峨眉伤科膀胱经推拿”可能具有延缓IDD的作用。但是,TrkA的蛋白表达水平同IDD的关系目前仍不完全清楚,并且TrkA在IVD细胞中可能具有其他重要功能,在本实验中各组间TrkA的蛋白表达差异无统计学意义,其对延缓兔IVD退化的作用仍需进一步研究。

再者,NPY、SP、CGRP、5-HT表达受NGF影响,故当NGF水平下降后,NPY、SP、CGRP、5-HT的表达也显著降低。其中NPY和SP可促进背根神经节细胞组织形态的修复[35],李江涛等[36]发现推拿联合针灸治疗血瘀型腰椎间盘突出症患者,可降低患者外周血中NPY、SP的含量,减轻疼痛。研究显示,CGRP参与了椎-基底动脉供血不足的“神经-血管”反馈调控机制[37]。贾国志等[38]发现推拿可以通过下调具有致痛作用的5-HT、上调具有止痛作用的β-内啡肽从而达到镇痛效果。本研究结果显示推拿组白兔血清中NPY、SP、CGRP、5-HT呈现表达量显著降低的趋势,结合以上研究,均提示推拿对血管和神经生长因子,以及血清中疼痛物质的表达有显著的调节作用。

综上所述,“峨眉伤科膀胱经推拿”可能通过调控IVD组织中神经和血管内皮生长因子表达从而延缓LIDD模型白兔的IVD退变进程。然而,LIDD受多条信号通路机制的调控,今后将进一步探究“峨眉伤科膀胱经推拿”对LIDD的作用机制。