血满草叶中绿原酸提取工艺优化及抗氧化活性

郭 蒙 ， 姜春红， 刘 韬， 王玉林， 勾 娜 ， 罗小虎，3

（1.黔南民族师范学院化学化工学院，贵州 都匀 558000；2.方拓生物科技（苏州）有限公司，江苏 苏州 215100；3. 贵州省高等学校材料失效与防护工程研究中心，贵州 都匀 558000）

绿原酸是植物体内有氧代谢的一种苯丙素类化合物。 具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保肝利胆、 调节糖和脂代谢等多种生物学活性功能（Bagdas 等，2020；梁永锋等，2018），在食品、化工、医药保健、饲料添加剂等方面都有应用（卓春柳等，2019；Santana-Gálvez 等，2017）。 据文献报道， 在畜禽养殖和畜牧生产中添加绿原酸类化合物，可有效改善肉的品质（丁浩轩等，2020），提高动物生长速率及繁殖能力，降低腹泻率，提高精液低温保存效果， 增强动物免疫功能等 （王璐等，2022；万凡等，2021；谢凯桓等，2021；刘静慧等，2020）。 如朱原等（2020）研究发现，甜叶菊中绿原酸与布氏乳杆菌协同发酵可促进雏鸡肠道改善；不同日龄蛋雏鸡添加甜叶菊绿原酸， 可改善盲肠菌群，并增强其机体免疫力（卓春柳等，2021）；刘静慧等（2021）发现，在肉兔饲料中添加绿原酸可改善其空肠结构形态， 提高生长性能； 张昊雪等（2022）发现，绿原酸还可抑制牛大肠杆菌和沙门氏菌。 食品中加入绿原酸还可起到保鲜防腐护色效果，如南美白对虾中加入绿原酸，可以保鲜（谢伊莎等，2021）； 饮料果汁中添加绿原酸具有防腐增色作用等（王云云等，2021）。

接骨木属植物血满草（Sambucus adnataWall.ex DC.），又称接骨丹、血管草、红山花、苛草等，其茎折断明显可见有红色液体流出， 主要分布在西藏、宁夏、贵州、云南等地，在藏族、傣族、彝族、哈尼族等少数民族中作为药用植物历史悠久（杨增明等，2007）。 血满草具有活血散瘀、祛风湿、利尿等药效，亦可用于跌打损伤、急慢性肾炎、风疹瘙痒等（沈笑媛等，2006）。临床应用方面血满草热浴可局部治疗新生儿硬肿症（王凤琼等，2009）；血满草为主要成分生产的制剂有傣药关通舒胶囊和关通舒口服液（刘向荣等，2005）。

研究报道血满草中含有萜类、黄酮类、醇类、木脂素类、 酚酸类、 脂肪酸类等化合物 （Li 等，2021；李巧月等，2019；刘冬丽等，2018）。 袁蕾等（2020）以纯化水和双水相K2HPO4、PEG6000 萃取体系为提取溶剂， 对血满草中多糖提取工艺进行了优化，并明确纯水提取溶剂中多糖的单糖组分。王文静等（2010）发现，血满草的水提物和醇提物对小白鼠灌服具有抗炎镇痛作用。Yuan 等（2020）从血满草叶子中纯化出的一种中性多糖可通过激活巨噬细胞和增强宿主免疫系统功能发挥免疫调节作用。但对于血满草中绿原酸的提取鲜有报道。本试验通过以单因素试验和Box-Behnken 试验设计， 旨在确定血满草叶子中绿原酸提取的最佳条件，同时对其抗氧化活性进行分析，为血满草资源的开发应用提供一定的基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 T6 新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、AR224CN 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、KH2200DE 数控超声波清洗器（上海沪粤明科学仪器有限公司）。

血满草叶，采自贵州都匀，自然晾干，粉碎过60 目筛封存保鲜袋内，干燥器内储存备用。 绿原酸对照品、维生素C 对照品（Vc），纯度≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司；2，2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），合肥巴斯夫生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 绿原酸提取工艺流程 血满草叶粉末→加提取溶剂→超声→离心→绿原酸提取液→稀释→紫外分光光法测定→计算。

1.2.2 标准曲线制作 移取一系列不同体积的0.1 mg/mL 绿原酸对照溶液， 加无水乙醇稀释定容，参考梁洁怡等（2021）制作绿原酸标准曲线，得回归方程为A=51.0173C-0.0042（R2= 0.9973）。

1.2.3 绿原酸提取率 移液枪吸取0.4 mL 样品提取液，置于10 mL 量瓶，根据1.4 方法测定，用下列公式计算血满草中绿原酸提取率。

式中：Y为血满草叶中绿原酸提取率，%；c为绿原酸浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为样品提取液体积，mL；m为血满草叶粉末质量，g。

1.3 单因素试验 单因素试验设计见表1。

表1 单因素试验设计

1.4 响应面优化血满草叶中绿原酸因素与水平依照单因素试验结果， 确定最高绿原酸提取率的四个单因素参数， 作为响应面试验优化血满草叶中绿原酸的零点水平，进行四因素三水平的Box-Behnken 试验设计（表2）。

表2 Box-Behnken 试验因素及水平

1.5 血满草叶中绿原酸抗氧化活性测定

1.5.1 DPPH 自由基清除活性测定 分别配制0.20 mmol/L DPPH 乙醇溶液、不同浓度的血满草叶提取液和Vc 溶液（王翔等，2018）。 避光环境下，分别移取无水乙醇、 不同浓度的血满草叶提取液或Vc 溶液2 mL， 加2 mL DPPH 乙醇溶液与其混合，37 ℃水浴30 min，517 nm 处测其吸光度， 各记为A1和A2。 DPPH 自由基清除率按下列公式计算。

1.5.2 ABTS 自由基清除活性测定 7.4×10-3mol/L ABTS 和2.6×10-3mol/L 过硫酸钾水溶液取相同体积混合，避光保存12 h 待用（Thaipong 等，2012）。试验时配制成734 nm 下吸光度为（0.70±0.02）的工作液。 分别移取0.4 mL 无水乙醇或不同浓度绿原酸提取液与3.6 mL ABTS 工作液混合，37 ℃水浴6 min，734 nm 处测其吸光度，各记为A’1和A’2。ABTS 自由基清除率按下列公式计算。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对血满草叶中绿原酸提取率的影响 由图1 可见，绿原酸提取率呈先升后降趋势，35%乙醇浓度时绿原酸提取率达到2.03%， 可能是因为乙醇浓度增大，溶剂极性降低，其他亲脂性杂质大量溶出的同时， 血满草叶中绿原酸溶出会随之减少（赵俊宏等，2021），因此试验采用体积分数为35%的乙醇溶液。

图1 乙醇浓度对血满草叶中绿原酸提取率的影响

2.2 液料比对血满草叶中绿原酸提取率的影响如图2 可见，液料比40：1（mL/g）时血满草叶中绿原酸提取率达到最大2.25%，之后开始下降。可能是液料比小时， 增大乙醇溶液的量会加速溶质传质，有利绿原酸的溶出，继续增加乙醇溶液时，醇溶性杂质会大量溶出，阻碍了绿原酸的溶出（许丹丹等，2020）。因此试验采用液料比为40：1（mL/g）。

图2 液料比对血满草叶中绿原酸提取率的影响

2.3 超声时间对血满草叶中绿原酸提取率的影响 如图3 可见，随超声时间增长，血满草叶中绿原酸提取率呈先增后减趋势，45 min 时达到最大值。 可能是因为提取时间的延长导致绿原酸被氧化、分解、结构被破坏或者杂质含量的增加，从而使绿原酸提取率下降（赵俊宏等，2021）。因此试验超声时间为45 min。

图3 超声时间对血满草中绿原酸提取率的影响

2.4 超声温度对血满草叶中绿原酸提取率的影响 如图4 可见， 随超声温度升高血满草叶中绿原酸提取率呈先增后急剧减小趋向，60 ℃时达到最大值。 这可能是因为绿原酸含有邻二酚羟基不稳定结构，在高温条件下，易被氧化，从而降低血满草叶中绿原酸提取率。 因此试验超声温度为60 ℃。

图4 超声温度对血满草中绿原酸提取率的影响

2.5 响应面试验结果

2.5.1 响应面试验设计 用Design Expert11.0 软件对表2 进行Box-Behnken 分析，所得试验结果见表3。 模型优化的数学回归方程为：Y= 2.21-0.1017A-0.0008B-0.3067C+0.1075D-0.2350AB-0.1425AC-0.0125AD+0.0425BC+0.0750BD-0.1450 CD-0.2102A2-0.1265B2-0.3977C2+0.1360D2。

2.5.2 响应面试验方差分析 方差分析结果见表4。 模型P值＜0.0001；失拟项P值0.2390＞0.05，说明此试验模型选择合适，在此试验条件下，对血满草叶中绿原酸提取率进行测定。 变异系数CV为1.33%， 在有效范围内。 模型R2=0.9974，Radj2=0.9944，表明此模型与试验数据的误差小，99.44%血满草叶中绿原酸提取率变化可用此试验模型解释。由表4 中F值可知，一次项中，除液料比对血满草叶中绿原酸提取率影响表现为不显著外，其余三项均为极显著，影响排序为：C＞D＞A＞B。二次项均为极显著。 交互项中除AD 项外，其余均极显著。

表4 方差分析

2.5.3 交互项作用分析 经表3 响应面数据分析可得交互项的3D 曲面和等高线变化图，3D 曲面图呈拱形或坡度陡峭时，等高线分布的越密，呈椭圆形或马鞍形时，交互项作用影响就越显著（曹艳华等，2020）。 由图5 可知，AB、AC、BC 交互项的曲面图坡度较陡峭， 等高线密集并呈典型的椭圆形，因此AB、AC、BC 交互项对血满草叶中绿原酸的提取率影响最显著。由AD 项3D 曲面图和等高线可得，随着超声温度的升高，血满草叶中绿原酸的提取率呈缓慢上升趋势；随着乙醇浓度的升高，血满草叶中绿原酸的提取率先缓慢上升至最高点再稍下降，曲线变化较为平滑，说明AD 之间交互作用较小。 BD、CD 交互项的3D 曲面图坡度相对较峻峭，等高线较密集且呈马鞍形，因此BD、CD交互项对血满草叶中绿原酸的提取率影响显著。由图5 分析可知， 结果与方差分析表3 中数据相一致。

图5 交互项对血满草叶中绿原酸提取率影响的响应面及等高线图

2.5.4 响应面最佳工艺试验条件验证 由软件Design Expert 对表3 数据优化分析得提取血满草叶中绿原酸的最佳工艺参数， 其乙醇浓度、 液料比、超声时间、超声温度分别为29.91%、46.92：1（mL/g）、40.61 min、70.00 ℃，此血满草叶中绿原酸提取率预测值为2.61%。 为验证预测结果的有效性和可行性， 实际操作最佳工艺采用乙醇浓度30%、液料比45：1（mL/g）、超声时间40 min、超声温度70 ℃，平行试验三次得到血满草叶中绿原酸的提取率平均值为2.55%，与该试验预测值相近，说明此试验模型适合血满草叶中绿原酸的提取。

2.6 血满草叶中绿原酸抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH 自由基清除活性 如图6 所示，在10 ～60 mg/L 试验浓度范围内， 血满草叶中绿原酸提取液与DPPH 自由基清除率呈正相关，Vc 溶液的DPPH 自由基清除率明显高于绿原酸提取液，Vc 溶液和绿原酸提取液IC50值分别为18.4 mg/L 和59.7 mg/L， 说明提取液中的绿原酸对DPPH 自由基有一定的清除作用。

2.6.2 ABTS 自由基清除活性 如图7 所示，在5～30 mg/L 试验浓度范围内，血满草叶中绿原酸提取液与ABTS 自由基清除率呈正相关，且Vc 溶液的ABTS 自由基清除能力较强。 绿原酸提取液浓度为30 mg/L 时，ABTS 自由基清除率达到61.5%。 Vc 溶液和绿原酸提取液的IC50值分别为6.5 mg/L 和23.0 mg/L，因此血满草叶中绿原酸提取液对ABTS 自由基有一定的清除作用。

图7 ABTS 自由基清除能力

3 结论

采用超声辅助乙醇浸取法对血满草叶中绿原酸提取条件进行研究， 依照单因素和响应面优化试验得最佳工艺条件为乙醇浓度30%、 液料比45：1（mL/g）、超声时间40 min、超声温度70 ℃，此条件下血满草叶中绿原酸的提取率达到2.55%。体外抗氧化能力研究表明， 血满草叶中绿原酸具有一定清除自由基作用，但Vc 对DPPH、ABTS 自由基的清除能力更强。