饲粮粗蛋白质水平对育肥牦牛生产性能和瘤胃微生物多样性的影响

来进成， 刘东花， 李润桦， 刘 丽 ， 窦莉蓉， 罗 兰

（1.甘肃省畜牧技术推广总站，甘肃 兰州 730000；2.山丹县畜牧技术推广站，甘肃 张掖 734000；3.新疆维吾尔自治区畜牧总站，新疆 乌鲁木齐 830000）

牦牛是生活在青藏高原及其毗邻的高山、亚高山高寒地区的大型反刍家畜，是当地牧民重要的生产、生活资料，具有不可替代的生态和经济学地位。对于牦牛养殖来说，精准的营养供给是提高生产性能、促进产业发展、增加牧民收入的重要策略。如何有效利用饲粮的营养水平调控牦牛瘤胃微生物区系，改善瘤胃内环境，进而提高饲料利用率和营养吸收率，是牦牛营养研究的一个重要方向。

瘤胃是反刍动物饲料发酵、 营养消化的重要场所， 可消化饲料中70% ～85%的可消化物和50%的粗纤维（潘美娟等，2012）。瘤胃功能的发挥主要依靠结构复杂和数量丰富的微生物群落，其中， 细菌在整个瘤胃微生物区系中约占95%；古细菌占比为2% ～4%；真核生物约占1%，主要由原生动物和真菌组成（Brulc 等，2009）。 瘤胃微生物之间相互协调、 相互制约共同维持着瘤胃内环境的平衡与稳定， 通过厌氧发酵帮助宿主将自身难以利用的纤维素、半纤维素、木质素和非蛋白氮等物质转化为可消化的化合物（韩旭峰，2015），为宿主提供65% ～75%的能量（郭红等，2022）。 此外，微生物本身随后在胃中被消化，并作为反刍动物的主要蛋白质来源。因此，建立稳定良好的微生物区系对维持机体健康、提高动物生产性能、改善动物产品质量、 减少环境污染等方面具有重要的意义（崔浩然等，2021），相反，瘤胃微生物区系的紊乱会导致宿主免疫力降低、生产性能下降等（马健等，2020）。因此，瘤胃微生物区系的研究一直是反刍动物研究的热点领域。

研究证实， 饲粮的改变可使瘤胃微生物群落打破原来的稳定微生态，建立新平衡，实现对微生物宿主的代谢调控， 进而影响生产性能 （唐鹏，2018）。粗蛋白质作为饲粮中仅次于能量的第二大营养源，是影响动物生长、发育、健康和环境的一个重要因素。 其含量变化会影响提供给反刍动物的氮源。 已有学者在肉牛、山羊、绵羊等反刍动物中进行了研究（李蒋伟等，2022；张春霞，2022；牛骁麟等，2020；唐鹏，2018；李秋凤等，2015），分析不同粗蛋白质水平对生产性能或瘤胃微生物区系的影响，但在牦牛上相关报道有限。 因此，本试验旨在研究饲粮不同蛋白水平对育肥牦牛生长性能、屠宰性能以及瘤胃微生物区系的影响，为牦牛养殖中合理调配饲粮蛋白水平， 进一步挖掘瘤胃微生物功能和调控机制提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理 试验用育肥牦牛均来自张掖市肃南裕固族自治县天然放牧的2.5 周岁左右牦牛， 于2021 年12 月收购运输至民乐县德华畜牧有限公司进行后续试验。 选取体重［（190.88±5.97）kg］ 相近、 体况良好的公牦牛12头，完全随机平均分成2 组，分别饲喂粗蛋白质水平为13.53%（D 组）和16.20%（G 组）的全混合日粮。按照试验设计，预饲期15 d，正饲期120 d。试验用全混合日粮依据我国 《肉牛饲养标准》（NY/T815-2004） 的肉牛营养标准推荐值和饲养经验进行配制。正式试验开始前对试验牛进行编号，每组单圈饲养。在牦牛熟悉并适应试验料，采食量达到正常状态（即体重的2%以上）正式开始试验记录。 每天9：00 和18:00 进行饲喂，自由采食，自由饮水，牦牛的管理按牛场常规要求进行，各组饲养管理条件保持一致。 全混合日粮组成及营养水平见表1。

表1 全混合饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.2 样品采集与处理 饲养试验最后一天晨饲前，利用胃管式采样器采集瘤胃液150 mL/头，经4 层无菌纱布过滤，分装至20 mL 离心管中，立即用液氮速冻后-80 ℃冰箱保存，用于后续分析（庞凯悦等，2022）。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 生长性能及屠宰性能测定 正式试验第1天和第120 天对所有试验牦牛进行空腹称重，记录初始体重和宰前活重， 计算总增重和平均日增重。 试验结束当天，对所有牦牛进行屠宰，记录胴体重并计算屠宰率。

1.3.2 瘤胃液微生物区系测定 将瘤胃液样品送至上海美吉生物医药科技有限公司， 根据E.Z.N.A.RsoilDNA Kit 试剂盒说明书提取12 个样本的微生物群落基因组DNA。 使用引物338F （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 对细菌16S rRNA V3 ～V4 区进行PCR 扩增， 通过Illumina Miseq PE300 型高通量测序仪进行测序。

1.4 数据统计与分析 生长性能、屠宰性能数据使用Excel 2010 软件进行整理， 利用SPSS 22.0软件进行统计分析和T 检验，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著，结果均以“平均值±标准差”表示。

微生物数据分析在上海美吉生物医药科技有限公司云平台上进行，使用fastp 和FLASH 软件根据overlap 关系对PE reads 进行拼接， 同时对序列质量进行质控和过滤，得到优化序列。 利用Uparse软件，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU 聚类， 在聚类过程中去除嵌合体， 得到OTU 的代表序列， 并对序列进行抽平处理。 由Mother 软件计算α 多样性指数。 采用RDP classifier 贝叶斯算法对OTU 代表序列进行分类学分析，通过与silva（Release138 http://www.arb-silva.de）数据库比对，获得各水平上的不同生物分类信息及其相对丰度信息，并分别在各个分类学水平统计群落物种组成。运用Wilcox 秩和检验比较两组在门、属水平上的菌落组成差异。分析结果以“平均值±标准差” 表示，P＞0.05 表示差异不显著，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同粗蛋白质水平饲粮对育肥牦牛生产性能的影响 由表2 可知，饲粮不同粗蛋白质水平对牦牛宰前活重、 胴体重和屠宰率的影响差异不显著，但D 组测定值均高于G 组（P＞0.05）。 随着饲粮蛋白水平的降低，D 组牦牛的总增重和平均日增重较G 组分别增加7.03%和6.94%（P＜0.05）。

表2 不同粗蛋白质水平饲粮对育肥牦牛生产性能的影响

2.2 育肥牦牛瘤胃微生物菌群丰富度和多样性分析 基于OTU 代表序列进行α 多样性分析，计算细菌丰富度（Sobs、Chao 和Ace）指数、多样性（Shannon 和Simpson）指数和覆盖度（Coverage）指数。 由表3 可知，本次测序覆盖率均达到98%以上，测序深度合理，测序范围能涵盖大部分区域。G 组和D 组牦牛微生物菌群在数量及结构上非常相似，D 组微生物丰富度和多样性略高于G组，但两组之间没有显著差异（P＞0.05）。

2.3 育肥牦牛瘤胃微生物菌群组成差异分析

2.3.1 门水平 在门水平上，两组共有19 个菌门（图1A）。 两组瘤胃微生物相对丰度＞1%的优势菌门有拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、 变形菌门 （Proteobacteria）、 螺旋体门（Spirochaetota）（图1B）。 拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度之和在各组中占比均高达92%以上，处于绝对优势地位。 在G 组样本中，相对丰度较高的菌门有拟杆菌门和螺旋体门， 分别为62.08%和1.62%，较D 组分别高出3.20%和0.54%；厚壁菌门和变形菌门在D 组中相对丰度较高，分别高于G 组2.21%和1.81%。 D 组和G 组在门水平上差异不显著（P＞0.05）（图1C）。

图1 不同蛋白组的牦牛瘤胃微生物组成（门水平）

2.3.2 属水平 在属水平上， 共鉴定出261 个菌属，两组共有237 个菌属，G 组特有13 个菌属，D组特有11 个菌属（图2A）。 在12 个样本中，微生物相对丰度＞1%的优势菌属有16 个， 其中，Prevotella （19.18% ）、norank_f__F082 （16.56% ） 和Rikenellaceae_RC9_gut_group（13.41%）的相对丰度高于10%， 其余13 个菌属相对丰度低于5%（图2B）。 运用Wilcox 秩和检验比较两组在属水平上的菌落组成差异。 在优势菌属中，Rikenellaceae_RC9_gut_group 的相对丰度在D 组中显著高于G 组（P＜0.05），UCG-002 的相对丰度在D组中极显著高于G 组（P＜0.01），其他菌属在两组之间无显著差异（图2C）。

图2 不同蛋白组的牦牛瘤胃微生物组成（属水平）

3 讨论

3.1 饲粮不同粗蛋白质水平对育肥牦牛生产性能的影响 蛋白质是配制日粮配方时的一项重要指标，不仅影响动物的生产性能，对机体健康、养殖效益以及生态环境都具有重要的作用。 饲喂过高的蛋白不仅会造成资源浪费，增加饲料成本，同时还会导致动物机体氮排泄增加，造成环境污染，此外， 还可能导致动物繁殖力下降 （韩旭峰，2015）。 而过低的蛋白质供应则无法满足动物营养需要，可能会造成增重减慢、饲料转化效率降低以及胴体质量下降等。因此，配制适宜蛋白水平的饲粮可最大限度地提高饲料利用效率， 促进牦牛的生长，改善胴体品质。 李秋凤等（2015）研究发现，饲养肉牛适宜的蛋白水平为12.5% ～16.0%。张春霞（2022）使用不同蛋白水平日粮饲喂西门塔尔牛，结果显示，随着蛋白水平的提高，平均日增重呈现先增加后降低的趋势， 中蛋白组与低蛋白组差异显著（P＜0.05），与高蛋白组差异不显著。代正阳 （2018） 研究发现， 饲喂中蛋白水平（14.95%） 日粮的金华黄牛试验组平均日增重高于饲喂高蛋白（16.6%）和低蛋白（13.45%）水平的两个试验组，但差异不显著。李红丽等（2022）利用3 个不同蛋白质水平 ［12%（低）、14%（中）、16%（高）］ 的全混合日粮分别饲喂3 组牦牛， 结果显示，中蛋白组的终末体重、总增重和平均日增重显著高于低蛋白质组（P＜0.05），同时也高于高蛋白组，但无显著差异。本试验结果与上述研究结果相似，13.53%蛋白组的总增重和平均日增重高于16.20%蛋白组，且差异达到显著水平。 当饲粮能量水平基本一致的情况下， 牦牛的育肥营养水平主要取决于蛋白水平。 科学合理的能氮比可促进瘤胃重要微生物菌群的生长繁殖， 有利于瘤胃微生物蛋白的合成， 提高瘤胃对营养物质的消化与吸收。 本研究中，过高的蛋白水平（16.20%）可能造成了饲粮能氮水平失衡， 进而影响了牦牛的生长性能（付敏等，2022；陈伟健，2008）。

屠宰性能是判断动物生产性能高低的重要指标，直接影响最终的经济效益。 王巍等（2020）认为，在相同能量水平下，蛋白水平的提高对屠宰性能无显著作用。张春霞（2022）研究表明，中蛋白组西门塔尔牛胴体重和屠宰率高于高蛋白组， 但差异不显著。本试验结果与上述研究结果相似，胴体重和屠宰率会随着日粮蛋白水平的提高而降低，但两处理组之间差异不显著， 说明蛋白水平对屠宰性能影响较小。根据本研究可得出，在不影响牦牛生长的情况下，适当地降低饲粮粗蛋白质含量，可有效降低饲养成本，提高生产效益。

3.2 饲粮不同粗蛋白质水平对育肥牦牛瘤胃微生物菌群丰富度与多样性的影响 α 多样性指数是衡量微生物菌群丰富度和多样性的综合指标。α 多样性越高，菌群组成越复杂、稳定，增强了对外界干扰的抵抗力和适应性， 有利于宿主健康（Jiang 等，2021）。 以往的研究认为不同蛋白水平对瘤胃微生物丰富度有显著影响， 但对多样性影响不大， 菌群丰度与蛋白水平呈负相关。 郭凯等（2019）研究表明，饲喂低蛋白日粮（19%）的90 日龄犊牛瘤胃微生物群落的Chao 指数显著高于高蛋白组（22%）（P＜0.05），两处理组间的Shannon指数没有显著差异。 Zhang 等（2021）以2 岁母牦牛为研究对象，饲喂4 种不同蛋白水平（9.64%、11.25%、12.48%、13.87%）饲粮，结果发现蛋白水平最高组（13.87%）的瘤胃微生物群的Ace 指数显著降低（P＜0.05），其他组之间差异不显著，不同组Shannon 指数之间差异不显著。 本研究结果发现牦牛瘤胃微生物菌群α 多样性指数在不同蛋白组之间均差异不显著， 但菌群多样性和丰度会随着饲粮蛋白水平的增高而降低， 与上述结果相似。说明在相同的食物成分下，改变粗蛋白质浓度并不足以引起瘤胃微生物群的强烈波动， 低蛋白组更有利于微生物繁殖。

3.3 不同粗蛋白质水平对牦牛瘤胃微生物菌群组成的影响 无论是品种、 饲养方式还是营养水平改变， 厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度都占据着反刍动物瘤胃微生物的主导地位， 其次还有少量的变形菌门、螺旋体菌门和软壁菌门等（李蒋伟等，2022；姜君等，2021；谭子璇等，2020；马力等，2019；Singh 等，2015）。 本研究结果与上述结论一致，在门水平下，两组相对丰度高于1%的菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和螺旋体门，在不同蛋白处理组之间差异不显著。 厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在牦牛瘤胃中占据绝对优势地位，占比达到92%以上，对牦牛健康起着非常关键的作用。厚壁菌门促进食物中的纤维降解，将纤维素转化为挥发性脂肪酸， 促进食物消化和生长发育； 拟杆菌门主要促进食物中蛋白质和碳水化合物的消化吸收， 从而促进胃肠道免疫系统的发育（Jiang 等，2021）。在本研究中，高蛋白组的拟杆菌门相对丰度高于低蛋白组， 以促进蛋白的消化利用。 变形菌门的相对丰度比拟杆菌门和厚壁菌门要低得多，但在瘤胃代谢中仍起着重要作用。变形菌门是细菌中最大的细菌门， 参与多种功能代谢，例如氮代谢等，此外，变形菌门还包括很多病原菌， 其数量的增加是生物失调和疾病风险的潜在诊断特征（Shin 等，2015）。 螺旋体门也同样发挥着重要的作用，能有效降解纤维素、果胶和磷酸盐，发酵形成挥发性脂肪酸，为反刍动物机体提供能量。以上研究说明，反刍动物都共享着一个核心瘤胃微生物菌群， 不会因饲粮中的一种营养成分的改变而引起厚壁菌门和拟杆菌门的优势地位发生改变。

许多微生物对饲料底物浓度比较敏感， 长时间饲喂不同营养水平的日粮，会使瘤胃菌群的数量和结构发生改变。 Henderson 等（2015）对水牛、野牛、绵羊、山羊、鹿、羊驼、大羊驼等32 个动物品种的瘤胃微生物进行研究，发现饲粮改变会引起瘤胃中微生物菌属的改变。本研究利用高通量测序技术分析发现，在属水平上，优势菌属共有16 个，其中7 个属于拟杆菌门，8 个属于厚壁菌门，1 个属于变形菌门。 相对丰度大于10%的菌属有Prevotella、norank_f__F082 和Rikenellaceae_RC9_gut_group。Prevotella 属于拟杆菌门，在瘤胃中一直处于优势地位，是瘤胃中主要蛋白降解菌属之一，参与淀粉和蛋白质的分解， 蛋白浓度的增加会引发普雷沃氏菌属数量增多（张洁等，2020）。 因此，本研究中高蛋白组的Prevotella 的相对丰度大幅度上升，成为瘤胃中占比最高的菌属。 Rikenellaceae_RC9_gut_group 属于拟杆菌门，可促进脂质代谢，参与短链脂肪酸，特别是丙酸的产生（Conte 等，2022）。Rikenellaceae_RC9_gut_group 还与宿主动物生长性能呈正相关， 其丰度在生长性能最好的动物中更高（Daghio 等，2021）。 本研究中，Rikenellaceae_RC9_gut_group 在低蛋白组的相对丰度显著高于高蛋白组（P＜0.05），同时低蛋白组的平均日增重显著高于高蛋白组 （P＜0.05）， 说明Rikenellaceae_RC9_gut_group 的数量会受到饲粮蛋白浓度的影响，同时其与生产性能可能成正相关，其是否影响反刍动物的生产性能还需进一步验证。UCG-002 属于厚壁菌门，在低蛋白组中相对丰度极显著升高（P＜0.01）。 UCG-002 的相关报道较少，功能可能与脂质代谢相关。 综上所述，饲粮蛋白水平的改变会对牦牛的瘤胃微生物组成产生一定影响。

4 结论

综上所述， 与16.20%蛋白水平饲粮相比，13.53%蛋白水平的饲粮更有利于育肥牦牛的生长，总增重和日增重显著增加。不同蛋白水平饲粮对瘤胃微生物α 多样性无显著影响，但对微生物优势菌属组成产生一定影响，13.53%蛋白水平饲粮更有利于瘤胃微生物的繁殖。 本研究为提高牦牛育肥生产效率、 优化瘤胃微生物区系提供重要参考。