保健食品中B 族维生素的快速分析方法研究

周新星，张玲玲*，周晓莹，施莎敏，任亦洋，贾福怀

（1.宁波御坊堂生物科技有限公司，浙江宁波 315012；2.宁波御益生物科技有限公司，浙江宁波 315012）

近些年，人们越来越意识到B 族维生素是人体不可缺少的重要营养素，市场上也出现越来越多的多种维生素片、复合维生素片以及维生素类功能饮料等保健食品。目前国家标准中测定B 族维生素含量的方法大多数前处理复杂、耗时长且成本高[1-4]。因此，研究出能同时快速准确分析保健食品中烟酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B2且前处理简单的检测方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集市场上畅销的3 种含多种B 族维生素的保健食品，作为实验1 号、2 号、3 号样品。

烟 酰 胺（ 批 号 为100115-202005， 纯 度 为99.9%）、维生素B1（批号为100390-202107，纯度为97.4%）、维生素B6（批号为100116-201906，纯度为99.9%）和维生素B2（批号为100369-201905，纯度为98.2%），均由中国食品药品检定研究院出品；乙腈（HPLC）、盐酸（GR），国药集团；三氟乙酸（HPLC），阿拉丁；超纯水，由Arium Comfort I 纯水超纯水一体机制得，其电阻率不大于18.2 MΩ·cm。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200 高效液相色谱仪（DAD 检测器），美国安捷伦公司；METTLER TOLEDO XS205DU 电子天平，梅特勒-托利多集团；KH-250DB 数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；Arium Comfort I 纯水超纯水一体机，赛多利斯（上海）贸易有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

精密称取维生素B2标准品10 mg 于适宜容量瓶中，加入盐酸溶液（1+1）2 mL 并超声溶解，然后用水定容摇匀，配成100 μg·mL-1的维生素B2标准储备液；分别精密称取20 mg 烟酰胺、维生素B1及维生素B6标准品于适宜容量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容摇匀，配成浓度为400 μg·mL-1的标准储备液。精密移取每种标准储备液适量，用0.1%三氟乙酸稀释定容，从而得到烟酰胺浓度100 μg·mL-1、维生素B1浓度50 μg·mL-1、维生素B6浓度50 μg·mL-1、维生素B2浓度50 μg·mL-1的混合标准溶液并逐级稀释成标准曲线。

1.3.2 样品处理

精密量取混合均匀的液体样品1 mL 或精密称取研磨混匀的固体样品0.1 g 于适宜的容量瓶中，加适量的0.1%三氟乙酸溶液，超声提取5 min，待样液冷却后定容摇匀，用0.45 μm 滤膜过滤，待测。

1.3.3 色谱条件

色 谱 柱：Agilent SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相：A 为0.1%三氟乙酸溶液，B 为乙腈，梯度洗脱见表1。

表1 流动相梯度洗脱

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

根据维生素B1、维生素B6、烟酰胺、维生素B2的理化性质[5]，对不同提取方法和提取溶剂进行研究，选择出最佳提取条件。

2.1.1 提取方法

以1 号样品为试样，考察了在室温下用0.1%三氟乙酸溶液超声提取5 min、手摇振荡提取5 min 和摇匀静置提取5 min 3 种不同提取方法对4 种B 族维生素提取效果的影响。结果显示，对于维生素B2，超声提取的提取率明显高于其他两种方法；对于其他3 种B 族维生素，3 种提取方法的提取率比较接近。综合考虑，后续实验均采用超声提取。

2.1.2 提取溶剂

以1 号样品为试样，考察了纯水、盐酸、0.1%三氟乙酸溶液的提取效果。实验结果显示，纯水对维生素B6的提取效果明显比其他两种溶剂差；盐酸对烟酰胺的提取效果明显比其他两种溶剂差；对于其他两种B 族维生素，0.1%三氟乙酸溶液的提取效果与其他两种溶剂相近。因此，在接下来的实验中都选用0.1%三氟乙酸溶液作为提取溶剂。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择

本次实验选择三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，提高分离效果，避免离子对试剂损害色谱柱的同时也大大降低了检测成本。

2.2.2 色谱柱的选择

通过实验对比了两款性能较优的C8柱与C18柱的分离效果，发现经过梯度洗脱程序优化后C8柱未能将维生素B1和维生素B6分离开，而且维生素B2出峰位置处有梯度引起的基线波动，会对结果造成影响，而C18柱的分离效果良好，因此后续实验均采用C18柱。同时本实验也比较了25 ℃、35 ℃及40 ℃柱温下4 种维生素色谱峰的分离效果，结果表明柱温改变对分离效果几乎无影响，因此后续实验均采用25 ℃柱温。

2.2.3 检测波长的选择

各种维生素最大紫外吸收波长都不相同，故本实验对4 种维生素在波长200 ～450 nm 进行紫外图谱扫描。在兼顾每种B 族维生素最大紫外吸收波长和灵敏度的基础上，实验采用紫外280 nm 检测，4 种B 族维生素的分离效果良好。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性实验

取适量1.3.1 项下的混合标准溶液和1.3.2 项下的试样溶液，根据1.3.3 项下的色谱条件进行实验。样品色谱图中B 族维生素的理论塔板数均大于5 000，分离度均大于1.5，均达到基线分离，因此本方法能进行定性定量分析。

2.3.2 线性关系及检出限实验

取1.3.1 项下的混合标准溶液，用0.1%三氟乙酸水溶液稀释制备成系列混合标准溶液，根据1.3.3项下的色谱条件进行实验，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，得到4 种维生素的回归方程。烟酰胺为y=3.273 4x+0.555 8，r=0.999 8；维 生 素B1为y=16.145x-4.039 7，r=0.999 8；维 生素B6为y=33.789x+0.32，r=0.999 9；维 生 素B2为y=58.074x-5.227，r=1.000 0。用3 倍信噪比（S/N=3）确定检出限，烟酰胺的检出限为0.3 μg·mL-1，其他维生素均为0.2 μg·mL-1。实验结果显示，烟酰胺在5 ～50 μg·mL-1呈直线回归，其他维生 素在2.5 ～25 μg·mL-1呈直线回归，相关系数均大于0.999 5，检出限低，所以本方法能进行定量分析。

2.3.3 精密度实验

（1）重复性。准确称取6 份实验1 号样品，根据1.3.2 项的方法进行供试液的配制，并根据1.3.3 项的色谱条件进行检测，测得各B 族维生素的相对标准偏差在0.41%～1.79%，表明该方法精密度高。

（2）重现性。不同实验员（n=3）用本方法对实验1号、2 号、3 号样品进行独立测定，其相对标准偏差在0.11%～1.96%，表明该方法重现性良好。

2.3.4 加标回收实验

准确称取6 份实验1 号样品，每2 份为1 组，共3 组，再分别加入低（样品浓度80%）、中（样品浓度100%）、高（样品浓度120%）的标准溶液，根据1.3.2 项的方法进行供试液的配制，并根据1.3.3项的色谱条件进行检测，计算得到回收率（表2）。测得各B 族维生素平均回收率在98.1%～99.6%，相对标准偏差在1.29%～2.06%，由此可见该方法回收率好。

表2 加标回收实验结果

2.4 实际样品的检测

用本方法和国家标准方法对实验1 号、2 号、3 号样品进行测定，并比较检测结果（表3）。本方法和国标方法测定结果偏差较小，均在允许范围内，因此本方法可用于保健食品中B 族维生素的检测。

表3 方法对比结果

3 结论

本文建立了同时测定保健食品中B 族维生素的方法，经过色谱条件的优化，成功实现了烟酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B2的基线分离。本方法操作流程简便，前期处理工作量少，实用性较高，能在25 min 内完成上述4 种维生素的同时检测，能为保健食品中B族维生素的同时分析提供实际帮助。