三七茎叶总皂苷抑制七氟醚诱导的海马神经元凋亡机制研究

文 艳，温 旭，李 靖，李 洋，黄先全，刘 康

（1.四川省南充市中医医院，四川 南充 637000； 2.四川绵阳四○四医院，四川 绵阳 621000； 3.四川省仪陇县人民医院，四川 南充 637600； 4.四川省南充市中心医院，四川 南充 637000）

七氟烷诱导和恢复时间快，血/气分配系数低，临床常用作吸入式小儿和成人麻醉剂［1-2］。两项前瞻性随机平行临床试验表明，七氟醚暴露可加重成人患者术后认知功能障碍［3-4］，甚至可能直接改变患儿脑结构和神经认知发育［5-6］。最常见的七氟醚诱导的损伤为细胞凋亡，机制复杂多样［7］。为此，临床中一直在寻找对抗神经元凋亡以减轻七氟醚诱导的神经认知障碍的方法［8］。三七叶作为一种高效低毒的中草药［9］，其根和茎已用于治疗心血管疾病［10］。三七及其提取物三七皂苷具有神经保护、抗炎、抗凋亡等作用［11］。三七总皂苷主要从三七根中提取、纯化获得；三七茎叶中的主要活性成分为皂苷，化学结构主要为原人参二醇型，具有镇静催眠、镇痛、调血脂、抗炎、延缓衰老等作用［12］。目前，三七茎叶总皂苷（PNSLS）已被证实具有保护神经的作用［13-14］。本研究中探讨了PNSLS 对七氟醚诱导神经元凋亡的调控机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：气密塑料室（AbbVie Inc.）；PM 8060 型气体监测器（德国Drager 公司）；NovoCyte 型流式细胞仪（美国ACEA Biosciences 公司）；Model 680 型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

试药：PNSLS（吉林省中医药研究院，批号为2018-05-08）；七氟醚（Merck Millipore，CAS号28523-86-6）；100 U/ mL 青霉素和100 μg/ mL 链霉素的Dulbecco's改良eagle 培养基（DMEM，美国Gibco 公司）；丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活剂anisomycin（批号为SC0132，10 mmol/L），Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（批号为C1075M），CCK - 8 试剂盒（批号为C0037），胱天蛋白酶- 3（caspase - 3）活性检测试剂盒（批号为C1115），BCA 蛋白质测定试剂盒（批号为P0009），均购于碧云天生物科技有限公司；抗Bax（ab32503，1∶1 000，21 000），B细胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl2，ab32124，1∶1 000，26 000），p38（ab170099，1∶1 000，42 000），p - p38（ab4822，1∶1 000，38 000），p65（ab32536，1∶1 000，65 000），IκBα（ab32518，1∶1 000，36 000），p - IκBα（1∶1 000，ab133462，36 000），78 000 葡 糖 调 节 蛋 白（GRP78，ab21685，1∶1 000，78 000），β- 微管蛋白（β- tubulin，ab6046，1∶500，50 000），Histone H3（ab1791，1∶2 000，15 000），均购于美国Abcam 公司；内质网应激相关蛋白（CHOP，Cell Signaling Technology，# 5554S，1∶1 000，27 000）。

细胞：小鼠海马神经元细胞系HT22（rocellLifeScience&Technology Co.，Ltd.，批号为CL-0697，以下简称HT22细胞）。

1.2 方法

细胞处理与分组：使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 于37 ℃、5%CO2加湿培养温箱中培养HT22 细胞，在具有入口和出口连接器的气密塑料室中进行细胞培养暴露。气密塑料室的入口用于调节七氟醚的浓度，与七氟醚蒸发器相连；用载气（95%空气、5%CO2）中0，4.1%，8%七氟醚对气密塑料室充气15 min，利用气体监测器监测气密塑料室出口的七氟醚浓度，直至达到目标浓度。37 ℃温度下保持密封6 h，对照细胞在37 ℃、5%CO2潮湿环境中生长，且不暴露于七氟醚。将HT22细胞分为对照组（Control组）；暴露于4.1%七氟醚的细胞组（Sev 组）；使用6 μg/ mL PNSLS对细胞进行预处理1 h，再将细胞暴露于4.1%七氟醚组（Sev + PNSLS 组）；于PNSLS 处理前1 h 加入MAPK激活剂anisomycin（An）再暴露于七氟醚和PNSLS的共培养组（Sev+PNSLS+An组）。

CCK-8法测定细胞活力：取HT22细胞（1×104个/孔），接种于96 孔板中，培养过夜，使细胞附着在板底部，向每孔加入10 μL CCK-8 试剂，放回培养箱中继续培养2 h。从96孔板取出，并置多功能酶标仪中，于450 nm 波长处测量每个孔的吸光度（OD），计算HT22细胞的相对活力。

细胞凋亡个数检测：为验证三七茎叶总皂苷对七氟醚诱导的神经元凋亡的保护作用，将质量浓度分别为1.5，3，6，12 μg/mL 的PNSLS与先前暴露于4.1%七氟醚的HT22 细胞进行孵化。将不同处理组细胞接种至12孔板（8×104个/孔）中，48 h后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并收集细胞，根据Annexin V -FITC/ PI 凋亡试剂盒说明书进行操作。于37 ℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡个数。

比色活性测定试剂盒测量caspase - 3 活性：收集HT22细胞，并在冰上的裂解缓冲液中孵育15 min，取裂解物，离心（15 000g、4 ℃）15 min，用BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。取10 μL裂解物，置80 μL反应缓冲液中（含10 μL 0.2 mmol/ L Ac - DEVD - pNA），于37 ℃温度下孵育2 h。用酶标仪于405 nm波长处测定OD。

免疫印迹（Western Blot）法测定内质网应激反应相关蛋白表达水平：为探讨七氟醚诱导的内质网应激反应对HT22 细胞的影响，在处理细胞6 h 后，评估内质网应激相关蛋白。用RIPA 裂解液提取HT22 细胞蛋白，离心（10 000g）10 min，提取上清液，用双辛烷酸蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；将20 μg 蛋白质样品在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分离，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；将PVDF膜置阻断缓冲液中孵育1 h，加入抗Bax，Bcl2，p38，p -p38，p65，IκBα，p - IκBα，GRP78，CHOP，β- tubulin，Histone H3，并孵育过夜；第2 天，用Tris - 缓冲盐水/Tween 20 清洗膜，用相应辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体孵育1 h。用高效化学发光（ECL）溶液测量成像发展系统中蛋白质的表达水平，以β- tubulin 和Histone H3为内参蛋白计算细胞或细胞核蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件分析。检验符合正态分布且方差齐时，计量资料以±s表示，行独立样本t检验；多组间比较采用One-Way ANOVA 分析；事后检验采用Tukey's multiple comparisons test。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 七氟醚抑制神经元活力

与七氟醚体积分数为0时比较，暴露于4.1%或8%七氟醚后，细胞活力均显著降低（P＜0.001），详见图1。用8%七氟醚的培养基处理神经元时，未发现神经元活力与4.1%七氟醚处理发生显著变化，故选取4.1%七氟醚处理神经元6 h。

注：*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。图2至图9同。图1 CCK-8法检测七氟醚对HT22细胞神经元活力的影响Note：*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1 - 9）.Fig.1 Effect of sevoflurane on neuronal activity of HT22 cells detected by the CCK-8 assay

2.2 PNSLS 增加神经元活力并抑制神经元凋亡

结果显示，与Sev + 3 μg/mL PNSLS组比较，Sev +6 μg/mL PNSLS组细胞活力显著升高（P＜0.01），详见图2。故选取6 μg/mL PNSLS作为治疗浓度。流式细胞术结果显示，PNSLS可显著抑制神经元凋亡（P＜0.01），详见图3。Western blot 法结果显示，与Sev 组比较，Sev+PNSLS组细胞中凋亡蛋白Bax表达水平显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著升高（P＜0.01），详见图4。且七氟醚处理后caspase-3活性显著增加，而PNSLS可逆转这一现状（P＜0.01），详见图5。可见，PNSLS能增加神经元活力。

图2 CCK-8法检测三七茎叶总皂苷对HT22细胞神经元活力的影响Fig.2 Effect of PNSLS on the neuronal activity of HT22 cells detected by the CCK-8 assay

A-C.流式细胞图（分别为Control组、Sev组、Sev + PNSLS组） D.柱状图图3 AnnexinV-FITC/PI法检测三七茎叶总皂苷对HT22细胞神经元凋亡率的影响A-C.Flow cytometry（Control group，Sev group，Sev+PNSLS group） D.HistogramFig.3 Effect of PNSLS on neuronal apoptosis of HT22 cells detected by the AnexinV - FITC/PI method

图4 Western blot法检测三七茎叶总皂苷对神经元凋亡相关蛋白表达水平的影响Fig.4 Effect of PNSLS on the expression level of neuronal apoptosis-related proteins detected by the Western blot

图5 比色法检测三七茎叶总皂苷对caspase-3活性的影响Fig.5 Effect of PNSLS on caspase-3 activity detected by the colorimetric assay

2.3 PNSLS 抑制七氟醚触发的内质网应激反应

Western blot 法结果显示，与Control 组比较，Sev 组和Sev+PNSLS组的GRP78和CHOP表达水平均显著升高；与Sev 组比较，Sev+PNSLS 组的GRP78 和CHOP 表达水平均显著降低（P＜0.01），详见图6。可见，七氟醚可能通过触发内质网应激反应诱导的凋亡信号通路促进HT22细胞凋亡，而PNSLS能部分逆转此凋亡。

图6 Western blot法检测三七茎叶总皂苷对七氟醚触发的内质网应激反应相关蛋白表达水平的影响Fig.6 Effect of PNSLS on the expression level of sevofluranetriggered endoplasmic reticulum stress-related proteins detected by the Western blot

2.4 PNSLS 介 导p38 MAPK / 核转录因子- κB（NF-κB）p65 信号通路调节七氟醚诱导的神经元凋亡

结果显示，七氟醚可升高p38 及IκBα 的磷酸化水平，以及NF - κB p65 向细胞核的核转位，而PNSLS 可逆转以上现象（P＜0.01），详见图7。为进一步验证PNSLS 介导p38 MAPK/ NF - κB p65 信号通路逆转七氟醚诱导的神经元凋亡现象，在使用PNSLS 及七氟醚的HT22 细胞中额外添加MAPK 激活剂anisomycin 对p38 MAPK/ NF - κB p65 通路进行激活。结果显示，MAPK 激活剂anisomycin 使p38 和细胞质中IκBα 的磷酸化水平显著升高（P＜0.01），细胞质中NF - κB p65水平显著降低（P＜0.01），详见图7。CCK- 8 法及流式细胞术结果显示，激活p38 MAPK/ NF - κB p65 通路，可抑制神经元活力，促进神经元凋亡（P＜0.05），详见图8 和图9。可见，PNSLS 通过介导p38 MAPK/NF-κB p65信号通路而调节七氟醚诱导的神经元凋亡。

图7 Western blot法检测三七茎叶总皂苷对p38 MAPK/NFκB p65信号通路相关蛋白表达水平的影响Fig.7 Effect of PNSLS on the expression levels of p38 MAPK/NF-κB p65 signaling pathway-related proteins detected by the Western blot

图8 CCK-8法检测MAPK激活剂对HT22细胞神经元活力的影响Fig.8 Effect of MAPK activator on neuronal activity of HT22 cells detected by the CCK-8 assay

A-B.流式细胞图（分别为Sev+PNSLS组、Sev+PNSLS+An组） C.柱状图图9 Annexin V-FITC/PI法检测MAPK激活剂对HT22细胞凋亡率的影响A-B.Flow cytometry（Sev+PNSLS group，Sev + PNSLS + An group）C.HistogramFig.9 Effect of MAPK activator on apoptosis of HT22 cells detected by the Annexin - V FITC/PI method

3 讨论

七氟醚为常用吸入性麻醉剂［15］，七氟醚麻醉的神经保护作用或神经毒性作用尚存在争议［16］。研究表明，神经炎症、钙失衡、神经元凋亡和氧化应激反应增强与七氟醚诱导的认知障碍密切相关［17-19］。据报道，4.1%七氟醚处理6 h 可显著诱导海马神经元凋亡；七氟醚可引发内质网应激反应，并可能导致神经元细胞凋亡［20］。内质网在超过1/ 3 蛋白质的合成、折叠和结构成熟中起重要作用［21］，其应激诱导的凋亡是神经疾病过程和神经元细胞死亡中的重要病理事件［22-23］。本研究结果显示，4.1%七氟醚显著抑制HT22 细胞的增殖并促进细胞凋亡；4.1% 七氟醚暴露可增加HT22 细胞中GRP78 和CHOP 蛋白表达水平及caspase - 3 活性，而PNSLS可逆转上述现象。

MAPK 家族是细胞表面受体和基因表达决定簇之间的重要信号调节酶［24］，包括胞外信号调节激酶1/ 2（ERK1/ 2）、c - Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）、p38、ERK5［25］，控制着几乎所有的生理功能和过程，如细胞适应、增殖、分化、存活和程序性细胞死亡［26］。p38 MAPK 是丝氨酸/苏氨酸MAPK 家族中高度保守的成员，其主要功能是向细胞传递细胞外信号［27］，可调节细胞增殖、分化、炎性反应、氧化应激反应、凋亡等病理生理过程［28-29］。p38 MAPK 信号通路参与缺血性脑损伤后大量神经元的晚期凋亡［26］，是缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的重要信号转导途径之一，与内质网应激激活有关［30-31］，在严重或持续的内质网应激反应下，p38 MAPK 磷酸化导致细胞功能障碍［32］。本研究结果显示，PNSLS 可减弱七氟醚诱导HT22 细胞p38 MAPK 磷酸化及内质网应激反应。

NF-κB是一种常见的核转录因子，广泛存在于细胞质中，并在细胞受到刺激时充当信号通路［33］。作为一种经典的炎性反应和氧化应激反应信号通路，NF-κB p65 信号通路通过调节趋化细胞因子、黏附分子、生长因子和各种酶的基因表达，在机体的炎性反应、免疫调节和细胞凋亡中发挥重要作用［34-35］。本研究结果显示，七氟醚可激活p38 MAPK/ NF - κB p65 通路，促使NF - κB p65 向细胞核的核转位，而PNSLS 可抑制该通路活性，经额外的MAPK 激活剂处理HT22 细胞的细胞活力显著下降，细胞凋亡显著上升。

综上所述，PNSLS通过介导p38 MAPK/NF-κB p65信号通路而抑制七氟醚诱导的神经元凋亡。但本研究仅探讨了细胞进程，未来研究中应开展动物体内实验。