高效液相色谱法同时测定扁蕾颗粒中5 种有效成分含量*

问 静，石春兰，韩达斌，刘海青，刘安平，李维业，徐文胜，邹存生，刘学良△

（1.青海省药品审评核查中心，青海 西宁 810007； 2.青海省西宁市食品药品检验检测中心，青海 西宁 810007； 3.三普药业有限公司，青海 西宁 810016）

扁蕾颗粒是藏药湿生萹蕾用水煎煮、浓缩后，取浸膏加辅料制粒干燥而成的单方制剂，具有清热燥湿、利湿干黄水功效，临床主要用于治疗小儿腹泻和肠胃炎［1］。湿生扁蕾Gentianopsis paludosa（Mum.）Ma 为龙胆科植物湿生扁蕾的全草，1 年或2 年生草本，花盛期采集，全草入药，产于西藏、青海、四川、云南等地，具有清温热、利胆、止泻功效，临床主要用于黄疸型肝炎、肝胆病引起的发烧、感冒、小儿腹泻等疾病的治疗［2-5］。目前，扁蕾颗粒收载于《卫生部药品标准·蒙药分册》［1］，仅有性状及检查项（颗粒剂制剂通则项目），不能有效控制药品质量。参考文献［6 - 12］，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定制剂湿生扁蕾中有效成分马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的含量，旨在为扁蕾颗粒质量标准的进一步研究提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），配有Waters 2998 PDA detector 型二极管阵列检测器；ME204 型电子天平（精度为0.1 mg），XS105DU 型超越系列专业型XS分析天平（精度为0.01 mg），均购于瑞士Mettler Toledo 公司；SB25 - 12DT 型新芝超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率为600 W，频率为50 kHz）；Milli-Q2355型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

马钱苷酸对照品（批号为111865-202005，纯度为97.5%），当药苷对照品（批号为111742-200501，纯度为99.27%），芒果苷（批号为111607 - 201704，纯度为98.1%），木犀草素对照品（批号为111720-202111，纯度为99.1%），均购自中国食品药品检定研究院；1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品（中科院西北高原生物研究所孙洪发研究员提供，纯度不低于96%）；甲醇（色谱纯，德国默克股份两合公司，批号为11163207138）；磷酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司，批号为Z0510032）；水为超纯水；扁蕾颗粒（三普药业有限公司，批号分别为190702，190703，190704，191002，191003，规格为每瓶12 g）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验［8-12］

色谱柱：Waters SunFire ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min 时20%A →25%A，5～7 min 时25%A，7～30 min 时25%A →55%A，30～35 min 时55%A →90%A，35～40 min 时90%A，40～45 min 时90%A →20%A，45～50 min 时20%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮色谱峰与样品中其他成分分色谱峰离度均大于1.5，理论板数均不低于5 000。色谱图见图1。

2.2 溶液制备

分别取马钱苷酸对照品10.56 mg，当药苷对照品8.10 mg，芒果苷对照品8.15 mg，木犀草素对照品5.71 mg，1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮对照品7.81 mg，精密称定，分别置50，10，100，10，50 mL容量瓶中，加甲醇超声使溶解并定容，摇匀，作为对照品贮备液；分别取上述对照品贮备液2，5，2，2，2 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇超声使溶解并定容，摇匀，即得马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮质量浓度分别为0.020 6，0.201 0，0.008 0，0.056 6，0.015 0 mg/mL的混合对照品溶液。

取样品适量，研细，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，摇匀，称定质量，超声提取（功率为250 W，频率为50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液（马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮质量浓度分别为0.020 6，0.201 0，0.008 0，0.056 6，0.015 0 mg/mL）1，2，5，10，15，20 μL，按2.1 项下色谱条件分别进样测定，以各待测成分的进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1，表明各待测成分在各自进样量范围内分别与峰面积线性关系良好。

表1 线性关系考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟 基- 3，8 - 二 甲氧 基酮峰面积的RSD分别为0.63%，0.26%，0.14%，0.16%，0.27%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为190702）适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件于0，2，4，8，16，24 h 时进样测定，记录峰面积。结果马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8 - 二甲 氧 基酮峰面积的RSD分别为0.96%，0.22%，0.13%，0.04%，0.79%（n=6），表明供试品溶液中上述成分在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为190702）6 份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算含量。结果马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮的平均含量分别为0.54，8.30，0.23，1.06，0.74 mg/ g，RSD分别为0.72%，1.06%，0.59%，0.42%，0.92%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为190702）6 份，每份0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入适量马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7- 二羟基- 3，8- 二甲氧基酮对照品，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮的平均回收率分别为96.24%，98.16%，96.67%，98.06%，97.84%，RSD分别为0.84%，0.89%，1.06%，0.92%，1.57%（n=6），表明方法准确度良好。

2.4 样品含量测定

取样品（批号分别为190702，190703，190704，191002，191003）0.5 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算各批次样品中马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7 - 二羟基- 3，8 - 二甲氧基酮的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果Tab.2 Results of the content determination of five components in samples

3 讨论

3.1 指标性成分与色谱条件选择

曾选择扁蕾颗粒中其他成分进行含量测定，结果含量较低，且无法有效分离，不建议作为扁蕾颗粒的定量检测指标。扁蕾颗粒临床用于小儿腹泻、胃肠炎的治疗，且疗效明确［13-15］。其主要有效成分马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7- 二羟基- 3，8- 二甲氧基酮具有抗炎、抗氧化、止泻、抑菌、抗肿瘤、保肝等多种药理学作用［16-24］，且分离度、重复性、稳定性均较好，故选择上述5种成分作为扁蕾颗粒的指标性成分。

对马钱苷酸、当药苷、芒果苷、木犀草素、1，7 - 二羟基-3，8-二甲氧基酮5种物质的甲醇溶液进行全波长扫描，于254 nm和365 nm波长处均有较强吸收，故选择254 nm 作为检测波长。参考文献［8 - 11］，选择甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、甲醇-水-磷酸等流动相系统及流动相梯度洗脱程序进行多次试验，最终选择甲醇-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱。

3.2 样品制备方法考察

对不同极性提取溶剂（水、乙醇、50%乙醇、甲醇、50%甲醇），不同提取方法（回流、超声、冷浸），不同提取时间（15，30，45，60 min）进行考察，从混合对照品溶液和供试品溶液中被测成分的分离情况、基线的稳定性及分析时间、含量、成本等方面综合分析，最终确定提取方法，即取样品0.5 g，以甲醇25 mL 为溶剂，超声30 min处理。曾以水为溶剂加热回流2 h（模拟扁蕾颗粒生产工艺）、甲醇为溶剂超声30 min 2 种方法提取湿生扁蕾药材得到的溶液进行比较，但水回流提取法的供试品溶液色谱行为与甲醇提取的供试品溶液差异较大。前者部分色谱峰较小，如已确认的木犀草素、当药醇苷等；个别色谱峰缺失，但不能确认具体成分。究其原因，主要与部分化合物在水、甲醇的溶解性差异较大有关；可能与化合物的热稳定性有关，如生产工艺规定第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，加热时间过长可能会造成个别不稳定化合物的含量降低。

3.3 方法评价

本研究中建立的方法操作简便、高效，结果准确，能为扁蕾颗粒的质量控制提供参考。