基于色谱法筛查及验证杞菊地黄口服液中抑菌剂*

吴 芳，王梦琪，罗定强，杨燕子，戴 涌

（陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

中药口服液制剂的生产过程中，常用苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类等作为抑菌剂［1-2］，以抑制微生物的生长和繁殖，在有效期内保证药品的质量。但部分抑菌剂对人体可产生一定毒副作用，如苯甲酸钠对肝、肾有一定损害，长时间大量摄入可能引起哮喘、荨麻疹等不良反应；对羟基苯甲酸酯类有弱雌激素活性。2020年版《中国药典》及药品说明书、药品标准中均对允许使用的抑菌剂品种和使用量有明确规定，生产时不可随意更改。杞菊地黄口服液由枸杞子、菊花、熟地等8味中药材组方，具有滋肾养肝功效。现行质量标准收载于《卫生部部颁标准·中药成方制剂第十一册》WS3- B -2146-96，对抑菌剂的描述为“加入抑菌剂适量”，规定不明确，但其药品说明书和外包装中均明确标示了品种和用量。为防止部分企业增添、更改抑菌剂的用量及品种，本研究中建立了常用抑菌剂的筛查及验证方法，并对市场上的杞菊地黄口服液进行了筛查。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC2030-3D 型高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadzu公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司，精度为0.01 mg）；Qtrap5500 型液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）仪（美国AB公司）。

1.2 试药

苯甲酸对照品（批号为100419 - 201703，纯度为99.9%），山梨酸对照品（批号为190126-201501，纯度为99.6%），对羟基苯甲酸甲酯对照品（批号为100278-201705，纯度为100%），对羟基苯甲酸丙酯对照品（批号为100444 - 201403，纯度为99.6%），对羟基苯甲酸丁酯对照品（批号为110792 - 200503，纯度为100%），均购自中国食品药品检定研究院；对羟基苯甲酸乙酯对照品（德国Dr.Ehrenstorfer Quality 公司，批号为G128088，纯度为99.0%）；乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯）；杞菊地黄口服液（7家生产企业，共65批，其中批号为170901的用于含量测定）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸铵溶液（B），梯 度洗 脱（0～9 min 时3%A，9～45 min 时3%A →85%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：255 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

供试品溶液：精密量取样品1 mL，置50 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L 乙酸铵溶液（6∶94，V/V）溶解并定容，摇匀，滤过，即得。

对照品溶液：分别取苯甲酸对照品16.51 mg、山梨酸对照品12.98 mg、对羟基苯甲酸乙酯对照品19.16 mg，精密称定，分别置50 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（6∶94，V/V）适量使溶解，定容，摇匀，制成质量浓度分别为329.870，258.562，379.368 μg/mL 的对照品贮备液；取对羟基苯甲酸甲酯对照品8.59 mg、对羟基苯甲酸丙酯对照品7.95 mg、对羟基苯甲酸丁酯对照品8.87 mg，精密称定，置同一50 mL 容量瓶中，加乙腈- 0.02 mol/ L 乙酸铵溶液（6∶94，V/V）适量使溶解，定容，摇匀，制成质量浓度分别为171.800，158.364，177.400 μg/ mL 的混合对照品贮备液。精密量取苯甲酸对照品贮备液、山梨酸对照品贮备液各5 mL，对羟基苯甲酸乙酯对照品贮备液1 mL，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯混合对照品贮备液5 mL，置同一25 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（6∶94，V/V）稀释并定容，摇匀，制成质量浓度分别为65.97，51.71，15.18，34.36，31.67，35.48 μg/mL的混合对照品溶液。

阴性对照品溶液：按处方工艺制备不含抑菌剂的阴性样品，精密量取阴性样品1 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果对照品溶液和供试品溶液中各色谱峰的分离度良好，供试品溶液（批号为170901）中检出苯甲酸和对羟基苯甲酸乙酯，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

1.苯甲酸 2.山梨酸 3.对羟基苯甲酸甲酯 4.对羟基苯甲酸乙酯 5.对羟基苯甲酸丙酯 6.对羟基苯甲酸丁酯A.混合对照品溶液 B.供试品溶液（批号为170901） C.阴性对照品溶液图1 高效液相色谱图1.Benzoic acid 2.Sorbic acid 3.Methyl 4 - hydroxybenzoate 4.Ethyl 4 - hydroxybenzoate 5.Propyl 4 - hydroxybenzoate 6.Butyl 4 -hydroxybenzoateA.Mixed reference solution B.Test solution（batch number：170901）C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察与检测限确定：精密量取2.2项下混合对照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，15.0，25.0，50.0 μL，按2.1项下色谱条件分别进样测定，以各抑菌剂的进样量（X，μg）为横坐标、峰面积响应值（Y）为纵坐标进行线性回归；以各抑菌剂响应值信噪比（S/N）为3∶1时的含量为检测限。结果见表1。

表1 6种抑菌剂线性关系考察与检测限确定结果（n=7）Tab.1 Results of the linear relation test and the limit of detection of six bacteriostatic agents（n=7）

精密度试验：分别精密量取2.2项下苯甲酸对照品溶液、山梨酸对照品贮备液各5 mL，对羟基苯甲酸乙酯对照品贮备液1 mL，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯混合对照品贮备液5 mL，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（6∶94，V/V）稀释并定容，摇匀，制成质量浓度分别为32.987，25.856，7.587，17.180，15.836，17.740 μg/ mL 的混合对照品溶液，精密量取上述对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件重复进样测定6 次，记录峰面积。结果苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯色谱峰面积的RSD分别为0.61%，0.13%，0.12%，0.22%，0.40%，0.31%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取样品（批号为170901）1 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，4，8，12，16，20，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯峰面积的RSD分别为0.41%和0.44%（n= 7），表明供试品溶液在常温下24 h内稳定性良好。

重复性试验：精密量取样品（批号为170901）1 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果苯甲酸和对羟基苯甲酸乙酯含量的RSD分别为0.81%和0.34%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取样品（批号为170901）0.5 mL，置50 mL容量瓶中，精密量取苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯对照品溶液（质量浓度分别为329.870，258.562，171.800，37.937，158.364，177.400 μg/ mL）各3 mL，置同一50 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液（6∶94，V/V）稀释并定容，摇匀，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 LC-MS/MS 法验证

采用LC 法对全部样品进行初步筛查，有12 批样品的色谱图中除检出标示的抑菌剂苯甲酸的色谱峰外，还检出疑似对羟基苯甲酸乙酯色谱峰。故采用LC-MS/MS法对可疑色谱峰进行确证，检测模式为多反应监测（MRM）模式；离子源为电喷雾电离（ESI）；碰撞气为氮气；扫描方式为负离子扫描；母离子质荷比（m/z）为165.000；子离子m/z为137.100，91.900，去簇电压（DP）均为-80.000 V，碰撞电压（CE）为-18.000 V 和-28.000 V。结果对羟基苯甲酸乙酯对照品溶液和2 批供试品溶液离子对色谱峰的相对保留时间均为4.26；离子比率分别为64.60%，63.86%，65.23%，偏差均小于±10%。故确认该色谱峰为对羟基苯甲酸乙酯。

2.5 样品中抑菌剂含量测定

取65 批样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。样品中抑菌剂含量测定异常（含量不足或品种不符）结果见表3，其余结果均符合规定。

表3 样品中抑菌剂含量测定异常（含量不足或品种不符）结果Tab.3 Results of abnormal content determination（insufficient content or different varieties）of bacteriostatic agents in samples

3 讨论

目前，抑菌剂含量测定方法多采用HPLC 法［3-8］、超高效液相色谱串联质谱法［9］和气相色谱法［10-12］。本研究中采用HPLC 法进行筛查，采用LC-MS/MS 法对筛查出的可疑样品进行验证，杜绝了误判的可能，达到了快速、准确、可靠的检测目的。流动相体系考察了乙腈-三乙胺溶液、甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液等，结果以乙腈- 0.02 mol/L 乙酸铵溶液梯度洗脱时，基线平稳，色谱峰分离度良好，故选择此溶液为流动相。根据测定结果，65 批样品中6 种抑菌剂的含量均未超过2020年版《中国药典（二部）》规定量的上限。但其中5批样品未检出药品说明书中规定的抑菌剂，12 批样品实际使用的抑菌剂品种与药品说明书或处方规定不符。

个别药品生产企业扩大范围使用抑菌剂对羟基苯甲酸乙酯，中药口服液通常呈酸性，杞菊地黄口服液的pH 值为3～4。目前广泛使用的抑菌剂主要有苯甲酸（钠）和山梨酸（钾），对羟基苯甲酸酯类抑菌剂更适用于中性溶液，未批准用于杞菊地黄口服液，不仅达不到防腐、抑菌作用，还会危害患者的健康［13-15］。故建议新增相应检验方法，以加强监管，规范生产。选择抑菌剂时，除考虑制剂pH 值的影响外，还应考虑制剂的长期稳定性，以及与辅料和包装材料的相容性，最佳使用量应为保证产品的抑菌体系有效的最低使用量，同时浓度应低于对人体的有害浓度。