李翅翔,黄玉兰,袁常珍,邹欣宴
(四川省泸州市市场检验检测中心,四川 泸州 646000)
枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果,于5~6月采收,干燥后直径为0.5~2.5 cm,具有破气消积、化痰散痞功效,可用于治疗积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸及脏器下垂[1]。枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实,于7 月果皮尚绿时采收,干燥后直径为3~5 cm,具有理气宽中、行滞消胀功效,可用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂[1]。枳实专利低位性气滞,枳壳专利高位性气滞[2]。枳实、枳壳主要有黄酮类[3-4]、生物碱类[5]、挥发油[6]、香豆素类[7]、三萜类[8-9]等成分,具有抗菌消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗氧化、升压、强心、促进胃肠道功能、抗抑郁等作用[10-16]。目前的研究主要集中于枳实、枳壳指纹图谱的分析[17-22],但大多方法复杂,且指认的共有峰较少,或样本量较少,不能全面、真实地反映枳实、枳壳药材的质量。为此,本研究中建立了46 批次枳实和40 批次枳壳的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,并进行相似度评价,为其质量控制和评价提供参考。现报道如下。
U3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技<中国>有限公司),配有二极管阵列检测器;XS205DU 型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司,精度为0.01 mg/0.1 mg);KH7200 型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司,功率为600 W,频率为50 kHz);UPHW - I - 90T 型微量分析超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。
橙皮苷对照品(批号为110721 - 202220,含量为97.2%),新橙皮苷对照品(批号为111857-201804,含量为99.4%),川陈皮素对照品(批号为112055 -202102,含量为99.7%),辛弗林对照品(批号为110217-202110,含量为99.8%),枳壳对照药材(批号为120981-202106),枳实(酸橙)对照药材(批号为120936 -202107),均购于中国食品药品检定研究院;枸橘苷对照品(批号为M25HB179212,含量为99.2%),N-甲基酪胺对照品(批号为7-RTU-100-1,含量为95%),均购于上海源叶生物科技有限公司;新北美圣草苷对照品(批号为22051001,含量为98.33%),芸香柚皮苷对照品(批号为PCS - 210309,含量为98.6%),柚皮苷对照品(批号为PCS-210913,含量为98.89%),柚皮素对照品(批号为PCS-210224,含量为99.21%),橙皮素对照品(批号为PCS-200811,含量为98.45%),桔红素对照品(批号为PCS-210123,含量为98.78%),均购于北京中科质检生物有限公司;乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技<中国>有限公司,批号为191614);甲酸(批号为20100610),甲醇(批号为2022011802),十二烷基磺酸钠(批号为20121023),均为分析纯,购于成都市科龙化工试剂厂;水为超纯水;枳实、枳壳样品信息见表1,产地均为四川泸州王湾枳实、枳壳种植基地,经四川省食品药品检验检测院主任药师黎跃成教授鉴定为正品。
表1 枳实和枳壳样品信息Tab.1 Information of Aurantii Fructus Immaturus and Aurantii Fructus samples
色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:枳实为乙腈(A)- 0.1%甲酸溶液和0.1%十二烷基磺酸钠溶液(B),枳壳为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B'),梯度洗脱(0~26 min 时18%A,26~73 min 时18%A →62%A,73~74 min 时62%A →18%A);流速:1.0 mL/ min;检测波长:283 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;分析时间:74 min。在此色谱条件下,对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液中,各成分均达到基线分离,理论板数按柚皮苷峰计应不低于5 000。色谱图见图1。
1.新北美圣草苷 2.芸香柚皮苷 3.柚皮苷 4.橙皮苷5.新橙皮苷 6.枸橘苷 7.辛弗林 8.柚皮素 9.N - 甲基酪胺 10.橙皮素 11.川陈皮素 12.桔红素A - B.对照药材溶液(枳实、枳壳) C - D.对照品溶液(枳实、枳壳) E - F.供试品溶液(编号分别为枳实S1、枳壳Q1)图1 高效液相色谱图1.Neoeriocitrin 2.Narirutin 3.Naringin 4.Hesperidin 5.Neohesperidin 6.Citrin 7.Synephrine 8.Naringenin 9.N - methyltyramine 10.Hesperetin 11.Nobiletin 12.TangeretinA - B.Reference medicinal materials solution(Fructus Aurantii Immaturus and Aurantii Fructus) C - D.Reference solution(Aurantii Fructus Immaturus and Aurantii Fructus) E - F.Test solution(numbered Aurantii Fructus Immaturus S1 and Aurantii Fructus Q1,respectively)Fig.1 HPLC chromatograms
供试品溶液:取46 批(编号为S1-S46)枳实药材,粉碎,过4 号筛,取粉末0.1 g,精密称定,置20 mL 容量瓶中,加甲醇适量,超声30 min,放冷,用甲醇定容,摇匀,用0.45 μm滤膜过滤,取续滤液,即得枳实供试品溶液。取40批(编号为Q1-Q40)枳壳药材,粉碎,过4号筛,取粉末0.1 g,精密称定,依上法制备枳壳供试品溶液。
对照药材溶液:分别取枳实、枳壳对照药材0.100 3 g和0.100 6 g,精密称定,按供试品溶液制备方法制备,即得。
对照品溶液:取新北美圣草苷对照品9.87 mg、芸香柚皮苷对照品9.03 mg、柚皮苷对照品10.36 mg、橙皮苷对照品15.29 mg、新橙皮苷对照品10.77 mg、枸橘苷对照品10.02 mg、辛弗林对照品10.17 mg、柚皮素对照品5.09 mg、N- 甲基酪胺对照品5.33 mg、橙皮素对照品4.90 mg、川陈皮素对照品10.63 mg、桔红素对照品5.71 mg,精密称定,置10 mL 容量瓶中,加甲醇分别制成单标贮备液;精密量取上述单标贮备液各适量,置同一20 mL 容量瓶中,加甲醇制备枳实对照品溶液(质量浓度分别为47.54,53.36,242.55,100.46,98.77,22.84,101.50,27.59,50.64,29.65,47.46,22.98 μg/mL)。取除辛弗林、柚皮素、N-甲基酪胺、橙皮素单标贮备液外制备枳壳对照品溶液。以柚皮苷对照品溶液作为参照物溶液。
精密度试验:分别取枳实样品(编号为S1)和枳壳样品(编号为Q1)适量,精密称定,依法制备供试品溶液,分别按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次,记录色谱图,以柚皮苷为参照峰,计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果,枳实样品的12 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.007%~0.538%范围之内,相对峰面积的RSD为0.021%~1.521%;枳壳样品的8 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.005%~0.047%,相对峰面积的RSD为0.601%~1.310%,表明仪器精密度良好。
稳定性试验:分别取枳实样品(编号为S1)和枳壳样品(编号为Q1),依法制备供试品溶液,分别于0,2,4,6,8,10,12,24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定,记录色谱图,以柚皮苷为参照峰,计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果枳实样品的12 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.074%~0.443%,相对峰面积的RSD为0.092%~1.997%;枳壳样品的8 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.007%~0.260%,相对峰面积的RSD为0.665%~1.983%,表明供试品溶液24 h内稳定性良好。
重复性试验:分别取枳实样品(编号为S1)和枳壳样品(编号为Q1),依法制备供试品溶液6 份,按2.1 项下色谱条件进样测定,记录色谱图,以柚皮苷为参照峰,计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果枳实样品的12 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.068%~0.333%,相对峰面积的RSD为0.383%~1.771%;枳壳样品的8 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.009%~0.133%,相对峰面积的RSD为0.233%~1.959%,表明方法重复性良好。
枳实:分别取2.2项下枳实对照品溶液和供试品溶液各10 μL,按2.1项下色谱条件进行色谱采集,通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)生成46批样品的色谱指纹峰,设定时间窗宽度为0.1 min,采用中位数法结合多点校正进行色谱峰匹配叠加(图2)及对照指纹图谱(图3)。通过与对照品溶液保留时间和紫外吸收光谱图对比,指认其中12个共有峰,分别为新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、N-甲基酪胺、辛弗林、川陈皮素和桔红素。
图2 46批枳实药材高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 46 batches of Aurantii Fructus Immaturus
图3 枳实对照药材高效液相色谱对照指纹图谱Fig.3 HPLC reference fingerprints of the reference medicinal materials of Aurantii Fructus Immaturus
枳壳:分别取2.2项下枳壳对照药材溶液和枳壳供试品溶液各10 μL,按2.1项下色谱条件进行色谱采集,通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 版)生成40批样品的色谱指纹峰,设定时间窗宽度为0.1 min,采用中位数法结合多点校正进行色谱峰匹配叠加(图4)及对照指纹图谱(图5)。通过与对照品溶液保留时间和紫外吸收光谱图对比,共指认8 个共有峰,分别为新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陈皮素、橘红素。
图4 40批枳壳药材高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.4 HPLC overlay fingerprints of 40 batches of Aurantii Fructus
图5 枳壳对照药材高效液相色谱对照指纹图谱Fig.5 HPLC reference fingerprints of the reference medicinal materials of Aurantii Fructus solution
HPLC 指纹图谱相似度评价结果显示,46 批枳实药材与枳实对照药材指纹图谱的相似度为0.900~0.996,非共有峰面积占比为2.13%~13.51%;40 批枳壳药材与枳壳对照药材指纹图谱的相似度为0.963~0.995,非共有峰面积占比为4.74%~15.08%。枳实、枳壳与对照药材的指纹图谱相似度均大于0.900,相似度良好。详见表2和表3。
表3 枳壳药材相似度Tab.3 Similarity of Aurantii Fructus
通过优化流动相、检测波长、柱温、流速等色谱条件,建立了合适的分析方法。方法学考察结果显示,精密度、重复性、稳定性良好,符合指纹图谱的技术要求,可靠性高,能作为枳实、枳壳药材的HPLC 指纹图谱的分析方法。
采用该方法对46 批枳实药材和40 批枳壳药材进样分析,与对照药材的相似度均大于0.900,表明枳实、枳壳与对照药材所含化学物质基本一致,不同采收时间得到的样品质量均一性较高,能对枳实、枳壳药材的质量进行整体描述及评价。通过与对照品溶液的保留时间和紫外吸收光谱图对比,枳实、枳壳药材分别指认了12 个和8 个共有峰,其中新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陈皮素、橘红素为两者共有成分,可作为枳实、枳壳药材的质量标志物[23],反映其共同点。相较于枳壳,柚皮素、橙皮素、N-甲基酪胺、辛弗林为枳实药材的特有成分,可体现二者的差异。
综上所述,本研究中建立的枳实、枳壳药材HPLC指纹图谱分析方法简单、结果准确可靠,样品的收集具有一定代表性,能为其质量控制和评价提供参考。