复方白头翁灌肠液质量标准研究*

陈 平，罗晓梅，曾于桦，杨 强，张亚峰，张 鹏

（四川省遂宁市中心医院，四川 遂宁 629000）

复方白头翁灌肠液主要由白头翁、黄柏、黄连、地榆、蒲公英、苦地丁等组方，具有清热燥湿、解毒消痈、凉血止痢等功效［1］，主要用于治疗溃疡性结肠炎。方中，白头翁为君药，具有清热解毒、凉血止痢功效；黄连清热泻火、燥湿厚肠，黄柏擅清下焦湿热，共为臣药，助白头翁清热解毒、燥湿治痢功效［2］。白头翁皂苷B4是白头翁的主要成分，具有抗炎、抗病毒、免疫调节等药理学作用［3］；小檗碱为黄连、黄柏共有成分，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、流感病毒等均有抑制作用［4-5］。目前，尚缺乏复方白头翁灌肠液的检测标准，为加强其质量控制，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对方中白头翁、黄连、黄柏、木香等中药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定复方白头翁灌肠液中白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；XS- 205 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；KQ - 250DE 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 试药

白头翁皂苷B4对照品（批号为RFS-B02901907022），盐酸小檗碱对照品（批号为RFS - Y03511811015），盐酸黄柏碱对照品（批号为RDD - Y08602108016），去氢木香内酯对照品（批号为RFS - Q01601906013），纯度均大于98%，均购自瑞芬思生物有限公司；白头翁对照药材（批号为121615-201603），黄连对照药材（批号为121752 - 201801），黄柏对照药材（批号为121510 -201807），木香对照药材（批号为120921 - 202010），均购自中国食品药品检定研究院；复方白头翁灌肠液（医院自制，批号分别为20211101，20211103，20211109）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

白头翁［6-7］：取样品（批号为20211109）10 mL，加正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并有机层，蒸干，加5 mL甲醇超声使溶解，即得供试品溶液。取白头翁皂苷B4对照品0.007 5 g，精密称定，加甲醇定容至25 mL，制成质量浓度为0.3 mg/mL 的对照品溶液。取白头翁对照药材1.056 g，加甲醇10 mL，超声0.5 h，滤过，取滤液，即得对照药材溶液。按处方工艺制备缺白头翁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，分别吸取上述溶液各4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶2，V/V/V）为展开剂，室温下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，冷却，日光下检视。供试品溶液、白头翁皂苷B4对照品溶液、白头翁对照药材溶液在薄层板上相应位置显相同颜色的斑点，斑点比移值较好，且阴性对照无干扰。详见图1 A。

1 - 7.供试品溶液 8 - 9.对照品溶液 10 - 11.对照药材溶液 12 - 13.阴性对照品溶液A.白头翁（日光） B.黄连（365 nm） C.黄柏（日光） D.木香（日光）图1 薄层色谱图1 - 7.Test solution 8 - 9.Reference solution 10 - 11.Reference medicinal material solution 12 - 13.Negative reference solutionA.Pulsatillae Radix（sunlight） B.Coptidis Rhizoma（365 nm） C.Phellodendri Chinensis Cortex（sunlight） D.Aucklandiae Radix（sunlight）Fig.1 TLC chromatograms

黄连［8-9］：取样品（批号为20211109）10 mL，加热蒸发至稠膏状，加甲醇10 mL，超声0.5 h，滤过，取滤液，即得供试品溶液。取盐酸小檗碱对照品0.006 3 g，精密称定，加甲醇定容至25 mL，制成质量浓度为0.252 mg/L的对照品溶液。取黄连对照药材0.103 1 g，加甲醇10 mL，超声0.5 h，滤过，取滤液，即得对照药材溶液。按处方工艺制备缺黄连、黄柏的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，分别吸取上述溶液各4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯- 异丙醇- 甲醇- 浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）为展开剂，置浓氨试液预饱和10 min的展开缸内室温下展开，取出，晾干，于紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、黄连对照药材溶液在薄层板上相应位置显相同颜色的斑点，斑点比移值较好，且阴性对照无干扰。详见图1 B。

黄柏［10-11］：取样品（批号为20211109）10 mL，加热蒸发至稠膏状，加1%醋酸甲醇10 mL，60 ℃超声0.5 h，滤过，取滤液，即得供试品溶液。取盐酸黄柏碱对照品0.012 7 g，精密称定，加甲醇定容至25 mL，制成质量浓度为5.080 mg/ L 的对照品溶液。取黄柏对照药材0.104 5 g，加1%醋酸甲醇10 mL，超声0.5 h，滤过，取滤液，即得对照药材溶液。按处方工艺制备缺黄柏的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，分别吸取上述溶液各4 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶2，V/V/V）下层有机溶液为展开剂，置浓氨试液饱和的展开缸内常温展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，日光下检视。供试品溶液、盐酸黄柏碱对照品溶液、黄柏对照药材溶液在薄层板上相应位置显相同颜色的斑点，斑点比移值较好，且阴性对照无干扰。详见图1 C。

木香［12-13］：取样品（批号为20211109）10 mL，加三氯甲烷萃取2次，每次10 mL，合并有机相，蒸干，加5 mL甲醇超声使溶解，即得供试品溶液。取去氢木香内酯对照品0.5 mg，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL 的溶液，即得对照品溶液。取木香对照药材1.004 0 g，加甲醇10 mL，超声0.5 h，滤过，滤液浓缩至2 mL，即得对照药材溶液。按处方工艺制备缺木香的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，分别吸取上述溶液各4 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮（10∶3，V/V）为展开剂，常温展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品溶液、去氢木香内酯对照品溶液、木香对照药材溶液在薄层板上相应位置显相同颜色的斑点，斑点比移值较好，且阴性对照无干扰。详见图1 D。

2.2 HPLC 法测定白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱的含量

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsustain C18键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL 加十二烷基苯磺酸钠0.1 g，30∶70，V/V，白头翁皂苷B4），乙腈- 0.1%磷酸溶液（每100 mL 加十二烷基苯磺酸钠0.1 g，50∶50，V/V，盐酸小檗碱）；检测波长：205 nm（白头翁皂苷B4），254 nm（盐酸小檗碱）；柱温：35 ℃（白头翁皂苷B4），40 ℃（盐酸小檗碱）；流速：1.0 mL/min；进样量：15 μL。

2.2.2 溶液制备

取白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱对照品各适量，精密称定，分别加甲醇超声0.5 h 至完全溶解，配制成质量浓度分别为0.910 mg/mL 和0.31 mg/mL 的对照品溶液。取样品10 mL，加正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并有机相，蒸干，残渣加5 mL 甲醇超声使溶解，即得供试品溶液Ⅰ；取样品10 mL，加热蒸发至稠膏状，加甲醇10 mL，超声0.5 h，滤过，取滤液，即得供试品溶液Ⅱ。按处方工艺分别制备缺白头翁、黄连和黄柏的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2.2 项下3 种溶液各15 μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果各色谱峰分离良好，峰形对称，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图2。

1.白头翁皂苷B4 2.盐酸小檗碱A1，A2.对照品溶液 B1，B2.供试品溶液 C1，C2.阴性对照品溶液（分别缺白头翁、黄连和黄柏）图2 高效液相色谱图1.Pulchinenoside B4 2.Berberine hydrochlorideA1，A2.Reference solution B1，B2.Test solution C1，C2.Negative reference solution（lack of Pulsatillae Radix，Coptidis Rhizoma，and Phellodendri Chinensis Cortex，respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2.2项下白头翁皂苷B4对照品溶液0.5，1，2，3，4，5 mL，分别置不同的5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超声15 min，制成质量浓度分别为91.00，182.00，364.00，546.00，728.00，910.00 μg/mL的系列对照品溶液；精密吸取2.2.2项下盐酸小檗碱对照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声15 min，制成质量浓度分别为31.00，62.00，124.00，186.00，248.00，310.00 μg/ mL 的系列对照品溶液。分别按2.2.1 项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y白=4 × 106X白+ 29 943（R2= 0.999 4，n= 6）和Y盐=4×106X盐+161 877（R2=0.999 5，n=6）。结果表明，白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱质量浓度分别在91.00～910.00 μg/mL 和31.00～310.00 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱对照品溶液（质量浓度分别为364.00，124.00 μg/mL）各15 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.45%和0.25%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20211109）样品6份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱的平均含量分别为287 μg/ mL 和78.52 μg/ mL，RSD分别为0.27%和0.16%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20211109）适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.35%和0.21%（n= 7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20211109）9 份，各10 mL，分别加入白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱对照品溶液（质量浓度分别为2.931 0 mg / mL 和0.254 0 mg/ mL）0.5，1.0，1.5 mL，各3 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n = 9）

2.2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为20211101，20211103，20211109）样品，各3 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，计算样品中白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱的含量。结果见表2。

表2 样品中白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱含量测定结果（mg/mL，n=3）Tab.2 Results of content determination of pulchinenoside B4 and berberine hydrochloride in samples（mg / mL，n = 3）

3 讨论

3.1 TLC 条件选择

黄连：参考2020 年版《中国药典（一部）》黄连项下TLC 法，以环己烷- 乙酸乙酯- 异丙醇- 甲醇- 水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V/V）为展开体系，置浓氨试液预饱和20 min 的展开缸内展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果斑点位置、数量与《中国药典》不符，原因可能为展开剂的组分和比例不适合供试品溶液的展开［8］。同时，考察展开体系苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V），乙酸丁酯-甲醇-异丙醇-水（10∶6∶3∶1.2，V/V/V/V），甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）对TLC法鉴别结果的影响，结果以甲苯- 乙酸乙酯- 异丙醇- 甲醇-浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）为展开剂时，黄连的TLC 鉴别效果较好。盐酸小檗碱偏碱性，在展开缸里加入浓氨试液改善斑点形状，但氨水添加顺序对黄连的TLC图有极大影响，发现浓氨试液饱和10～30 min可明显改善斑点的形状，若饱和时间过长，斑点呈扁圆形甚至直接融合成直线［14］。同时，考察不同观察方法（紫外光灯254 nm 和365 nm）及不同展距（7，8，9 cm）对TLC图的影响，最终确定以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）为展开剂，浓氨试液饱和时间为10～30 min，展距为8 cm，紫外光灯（365 nm）下检视的分离效果较好，主斑点比移值适宜，且斑点清晰。

白头翁：参照2020 年版《中国药典（一部）》白头翁TLC 法制备供试品溶液，将复方白头翁灌肠液旋干，加适量甲醇超声，过滤，即得；并尝试使用不同展开系统［15-17］对白头翁进行TLC 鉴别，但常出现载样量偏大、拖尾严重、白头翁皂苷B4斑点几乎在基线上，达不到分离要求。改用正丁醇为提取溶剂，直接提取复方白头翁灌肠液，蒸干后加入甲醇充分溶解，作为供试品溶液，尝试不同展开剂系统［氯仿- 甲醇- 水（7∶3∶0.5，V/V/V），正丁醇- 冰醋酸- 水（4∶1∶2，V/V/V）］，结果展开剂为后者时对照品溶液与供试品溶液色谱中白头翁皂苷B4的斑点在一条直线上，斑点清晰，分离效果较好。故最终确定2.1项下白头翁的TLC鉴别法。

3.2 HPLC 法指标成分选择

方中，白头翁具有较强的抗菌活性，可用于细菌性痢疾、感染性腹泻、溃疡性结肠炎等疾病的治疗［18］。君药白头翁的主要活性成分白头翁皂苷B4的抗炎、抗病毒效果显著［19-20］；黄连、黄柏共有成分小檗碱具有抗菌、抗病毒等药理作用［3］，用于治疗急性肠胃炎、消化性溃疡、腹泻等多种细菌引起的消化系统疾病的疗效显著。故本研究中选择白头翁皂苷B4、盐酸小檗碱作为指标性成分进行含量测定。

3.3 盐酸小檗碱含量测定流动相选择

2020 年版《中国药典（一部）》黄连含量测定项下盐酸小檗碱的流动相为乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液（50∶50，V/V），每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调pH 值为4.0；黄柏含量测定项下盐酸小檗碱的流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，V/V），每100 mL 加十二烷基磺酸钠0.1 g。两组流动相中均加入了十二烷基磺酸钠，其阴离子可与被测组分离子结合，提高分离度，优化分析效果［21-22］。本研究中发现，在磷酸二氢钾溶液中每100 mL 加十二烷基硫酸钠0.4 g，十二烷基硫酸钠需加热搅拌才能完全溶解，但冷却至常温后溶液又变浑浊。故最终确定以乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL 加十二烷基苯磺酸钠0.1 g）作为流动相，检测波长为254 nm，柱温为40 ℃，流速为1.0 mL/min，在此色谱条件下，盐酸小檗碱保留时间适宜，基线平稳无漂移，与杂质峰分离良好。

3.4 方法评价

本研究中建立的方法操作简便、结果准确可靠、重复性好，可用于复方白头翁灌肠液的质量控制。