网络药理学分析结合细胞实验探讨黄芪汤抗肝纤维化的作用机制

秦 艳，李亚娟，王清兰

1.上海中医药大学交叉科学研究院（上海 201203）；2.上海中医药大学中医学院（上海 201203）

肝纤维化是肝脏对多种慢性损伤的一种修复愈合反应，以肝组织内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度增生与异常沉积为特征，是多种慢性肝病的重要病理特点，也是慢性肝病向肝硬化发展的必经过程。肝硬化是肝纤维化的末期，进而可能发展为肝癌。据估计，肝纤维化影响全球人口的1%至2%，并导致全世界每年超过100 万人死亡［1-3］。现代医学除针对某些病因的治疗外，目前尚缺乏理想的生物或化学临床治疗药物。中医药在肝纤维化的治疗上具有明显的优势。

黄芪汤始载于《太平惠民和剂局方》，黄芪与甘草剂量比例为6∶1，故又名黄芪六一汤。方中黄芪甘温，大补肺脾之气，固表止汗，托毒生肌，补气以生血，补气以生津液，为君药。炙甘草补脾益气和中，助黄芪益气补虚之力，为臣佐药。两药配伍，甘以守中，补中益气之力增，气血津液化生有源，则气弱血虚所致诸症自愈，是经典补气药方之一［4］。研究发现，黄芪汤对四氯化碳（CCl4）、胆管结扎（BDL）及二甲基亚硝胺（DMN）［5］等不同因素诱导的实验性肝纤维化模型均具有良好的预防及治疗作用［6-7］，其作用机制值得进一步研究。

网络药理学可从整体角度研究药物的作用机制，适合于分析中药复方多成分、多靶点的作用特点。本研究首先采用网络药理学方法初步发现黄芪汤抗肝纤维化的作用靶点并对靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，获得黄芪汤成分调控的关键信号通路，并构建“靶点-信号通路”网络图。肝星状细胞活化是肝纤维化的主要细胞学基础，本研究进一步采用人肝星状细胞系人肝星状细胞LX-2（简称“LX-2细胞”），基于网络药理学结果进一步采用细胞实验验证黄芪汤抗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 LX-2 细胞株，由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授赠送。

1.1.2 药物与试剂 黄芪汤（黄芪、甘草）由上海中医药大学附属曙光医院国家中医药管理局中药制剂中心（国家中医药管理局三级实验室）制成粗粉末，水煎，浓缩煎出液制成流浸膏后真空干燥，-20 ℃冷藏保存。生药总质量为8.0 kg，煎煮浓缩后为1.115 kg，真空干燥后质量为1.52 kg，每克含生药5.263 g。

含各种氨基酸和葡萄糖的培养基（DMEM），美国HyClone 公司（批号：AE29040273）；互补脱氧核糖核酸合成试剂盒（iScriptTM cDNA Synthesis Kit）、荧光染料定量 PCR 试剂（iTaqTM Universal SYBR®Green Supermix），美国Bio-Rad 公司（批号分别为1708891、1725122）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、兔单克隆抗体、蛋白激酶B（Akt）1/2/3 兔单克隆抗体，碧云天生物技术有限公司（批号分别为AF0006、AF1186、AF1789）；抗Akt 磷酸化T308（phospho T308）抗体，美国Abcam 公司（批号：ab38449）；抗磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抗体、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、I型胶原蛋白（Col-I）抗体，均购自美国Cell Signaling Technology公司（批号分别为4255S、19245S、72026S）。

1.1.3 仪器 脱色摇床，其林贝尔仪器制造有限公司（型号：TS8）；制冰机，日本Sanyo 株式会社（型号：SIMF140AY65）；恒温微孔板快速振荡器，其林贝尔仪器制造有限公司（型号：QB-9006）；恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司（型号：S23-2）；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司（型号：AL204）；PCR 扩增仪，德国Biometra 公司（型号：Thermocycler）；低温高速离心机，美国Eppendorf 公司（型号：5425）；实时荧光定量PCR，美国ABI 公司（型号：7500Fast）；酶标仪，美国Molecular Devices 公司（型号：Spectramax 190）；超净台，美国Labconco 公司（型号：3612524）；蛋白质电泳及转印系统/核酸蛋白测定仪，美国Bio-Rad 公司（型号：turbo1704150）；化学发光显影仪，上海天能科技有限公司（型号：Tanon5200）。

1.2 黄芪汤抗肝纤维化网络药理学分子分析结合细胞实验验证研究思路 本研究首先通过中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、化源网（Chemsrc）数据库（https：//www.chemsrc.com/）以及检索文献获得所有的黄芪汤的活性成分。通过TCMSP、化合物靶点预测（Swisstarget prediction）数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）、药物银行（DrugBank）数据库（https：//www.drugbank.ca）获得化学成分的作用靶点，即药物靶点；再通过全基因（Gencards）数据库（https：//www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（http：//www.omim.org）等获取肝纤维化的主要靶点，即疾病靶点。取上述交集获得黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点；利用富集分析（Metascape）数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）进行KEGG 通路富集分析，获得黄芪汤抗肝纤维化关键信号通路；最后采用LX-2 细胞验证黄芪汤对上述关键信号通路的影响，阐述黄芪汤抗肝纤维化的部分作用机制。本研究思路见图1。

图1 网络药理学结合细胞实验验证探讨黄芪汤抗肝纤维化作用机制研究思路图

1.3 黄芪汤抗肝纤维化网络药理学分子分析

1.3.1 黄芪汤化学成分及有效靶点的筛选 通过

TCMSP、Chemsrc 确定黄芪、甘草的化学成分，根据口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 两个药代动力学（ADME）属性值进行活性成分初步筛选以获得活性化合物及其作用靶点，再根据Swisstarget prediction、DrugBank 数据库和已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。筛选结束后，将蛋白质靶点信息统一在通用蛋白质（Uniprot）数据库（https：//www.uniprot.org）将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

1.3.2 肝纤维化相关疾病靶点筛选 以“hepatic fibrosis”“liver fibrosis”为关键词，采用Gencards 数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM 数据库（http：//www.omim.org）挖掘影响肝纤维化的潜在靶点。在Genecards 数据库中筛选出评分（Score）值相对较高的靶点，其分值越高表示与疾病的联系越密切。根据一般方法经验筛选Score 大于两倍中位数的目标靶点为肝纤维化的潜在靶点，在Genecards 数据库中所得肝纤维化靶点Score 最大值为129.16，最小值为0.12，两倍中位数为8.4，故设定Score＞8.4 的靶点为肝纤维化的潜在靶点。最后合并4 个疾病数据库筛选出的靶点作为肝纤维化的疾病靶点。

1.3.3 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点的筛选 利用韦恩图（http：//www.bioinformatics.com.cn）获得药物靶点和疾病靶点的交集，即为黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点。

1.3.4 生物学功能与通路的富集分析 Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）是一个具有较为全面的注释功能和定时更新基因注释的数据库。将黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点输入Metascape 数据库平台，选择“人”（Homo sapiens，Human），设置P＜0.01，最小计数为3和富集因子＞1.5（富集因子是观察到的计数与偶然预期的计数之间的比率）来进行KEGG富集分析，保存数据结果并采用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）对数据进行可视化，得到黄芪汤抗肝纤维化靶点所富集的信号通路。

1.3.5 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点-信号通路网络图的构建 运用CytoScape 3.8.1 软件，根据筛选出来的黄芪汤抑制肝纤维化潜在靶点和KEGG 分析结果，构建肝纤维化靶点-信号通路网络图。

1.4 黄芪汤对LX-2细胞活化及关键信号通路的影响

1.4.1 细胞培养 LX-2 细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基中，置于5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养，待细胞长至亚单层后用于实验。

1.4.2 分组与干预 LX-2 细胞，设置正常对照组（control）、黄芪汤低剂量组（25 mg/L）、黄芪汤高剂量组（50 mg/L），给药后培养24 h，按检测指标要求收集细胞，每组设3个复孔，每个实验重复3次。

1.4.3 Western blot 法检测α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表达情况 每个培养皿用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗两遍后，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液150 μL ，按照二喹啉甲酸（BCA）法检测总蛋白含量。取20 μg 总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经硝酸纤维素膜转移，室温封闭（5%脱脂奶粉，1 h）后，分别与特异性一抗孵育，洗涤，再孵育相应二抗（摇床室温1 h），洗涤后增强型化学发光试剂（ECL）化学发光，胶片曝光，图像分析仪通过光密度测定法定量测量。

1.4.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测细胞内基因表达情况 采用RT-qPCR 法检测LX-2 细胞纤维化相关mRNA 的表达，分别为α 平滑肌肌动蛋白基因（α-SMA），Ⅰ型胶原蛋白基因（Col-Ⅰ），磷脂酰肌醇-3-激酶基因（PI3K）。用TRIzol试剂提取总RNA，测定其浓度。逆转录为10 μL 体系，根据试剂说明书操作，轻柔混匀后按照条件进行逆转录。反应条件：25 ℃、5 min；46 ℃、20 min；95 ℃、1 min；4 ℃保存，-20 ℃储存备用。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本实验中所用引物序列见表1。反应体系为10 μL 体系。反应条件：预变性，95 ℃、30 s，1个循环；PCR 反应，95 ℃、15 s，40个循环，50 ℃、60 s，40个循环。以18s作为内参，所有反应体系均为2个复孔。

表1 引物序列

1.5 统计学方法 实验数据采用GraphPad Prism6.02软件进行分析。计量资料用±s表示，多组间比较采用one-way ANOVA 进行统计分析，应用Tukey's multiple comparisons test 进行组间两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪汤中化学成分的筛选 黄芪汤由黄芪、甘草组成，在TCMSP 数据库中检索到黄芪成分87 个，甘草成分280个，共367个成分。设定筛选参数为OB≥30%、DL≥0.18，获取黄芪成分20个、甘草成分92个，共112个有效成分。根据文献以及靶点一一对应，最终筛选出21 个黄芪有效成分、92 个甘草有效成分，共同成分3 个。见表2。

表2 黄芪汤主要化学成分

2.2 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点的筛选 首先通过TCMSP 数据库预测黄芪汤中化合物的靶点，Swisstarget prediction 数据库再筛选做补充，最后为了标准化蛋白质靶点信息，统一在Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org）中将蛋白质靶点进行规范。黄芪成分中筛选出253 个靶点，甘草成分中筛选出226 个靶点，合并后删除重复值，共得到282个靶点。

通过Genecards 数据库，根据一般经验筛选获得肝纤维化靶点1 643 个。结合OMIM 数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1 689 个与肝纤维化相关靶点。

将上述化合物靶点和疾病靶点通过微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）取交集，绘制出韦恩（VENN）图［8］，共筛选出153 个黄芪汤成分抗肝纤维化的潜在作用靶点。见图2。

图2 黄芪汤和肝纤维化靶点韦恩图

2.3 黄芪汤成分-疾病靶点交集信号通路分析 应用Metascape数据库对黄芪汤抑制肝纤维化相关靶点进行信号通路分析，借助Origin Lab 2018 对结果可视化。KEGG 富集分析结果显示，核心靶点与癌症途径、乙型肝炎、晚期糖基化终末产物（AGEs）-糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路、癌症中的蛋白多糖白介素-17（IL-17）信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3KAkt）信号通路、5'-单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路、分泌型糖蛋白Wnt 信号通路等密切相关。见图3。

图3 黄芪汤成分-疾病靶点京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析图

2.4 黄芪汤抗肝纤维化潜在靶点-信号通路网络图的构建 运用CytoScape 3.8.1 构建黄芪汤抗肝纤维化靶点-通路网络，得到黄芪和甘草成分与肝纤维化交集靶点以及核心通路网络。见图4。

图4 黄芪汤抗肝纤维化核心靶点-关键通路网络图

2.5 黄芪汤对LX-2 细胞活化的影响 体外研究黄芪汤对LX-2 细胞活化的影响，结果发现，与正常对照组比较，黄芪汤高、低剂量组均可显著下调LX-2 细胞α-SMA、Col-Ⅰ蛋白和mRNA表达（P＜0.05），提示黄芪汤可体外抑制HSC的活化及胶原生成。见图5。

图5 黄芪汤对LX-2细胞活化的影响

2.6 黄芪汤对LX-2 细胞PI3K-Akt 信号通路的影响体外研究黄芪汤对LX-2 细胞PI3K-Akt 信号通路的影响，结果发现，与正常对照组比较，黄芪汤高、低剂量组可显著下调LX-2 细胞PI3K 蛋白及mRNA 表达，黄芪汤高、低剂量组可显著抑制Akt 蛋白磷酸化（P＜0.05），提示黄芪汤可体外抑制PI3K/Akt信号通路。见图6。

图6 黄芪汤对LX-2细胞中PI3K/Akt通路的影响

3 讨论

肝纤维化是一种病理性病变，其特征是胞外基质（ECM）在窦周间隙中逐渐积累，是多种慢性肝病的共同病理环节［9］。如果未得到适当及时的干预，肝纤维化可进一步发展为肝硬化，而肝硬化是全世界最常见的致死性疾病之一［10］。HSC 的活化在肝纤维化的进展中起着核心作用，减慢肝损伤中活化HSC 的增殖是解决和治疗肝纤维化的重要策略［11］。

黄芪汤由黄芪、甘草组成，现代药理研究［12］发现其主要有效成分为黄芪皂苷、黄芪多糖等，具有调节免疫、促进机体代谢、抗菌等作用。动物实验研究［13-16］发现其可以改善二甲基亚硝胺（DMN）模型大鼠肝纤维化，改善肝组织病理，降低肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量，提高肝组织SOD 活性，进而提高抗氧化应激效应。黄芪和甘草等均可以通过抑制HSC 活化、减少胶原形成［13，17］等起到抗肝纤维化的作用。黄芪汤抗肝纤维化的作用明确，但其作用机制仍不清楚。网络药理学从整体角度出发，通过药物、靶点、疾病之间的关系分析揭示药物的作用机制，非常适合研究中药复方多成分、多靶点的作用，为中药复方的研究提供了新的思路，因此本研究基于网络药理学结合体外细胞实验进一步探讨黄芪汤抗肝纤维化的作用机制。

本研究首先基于网络药理学预测出黄芪汤抗肝纤维化的潜在靶点及机制，并进一步通过KEGG 信号通路分析，发现黄芪汤与IL-17 信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、AMPK信号通路、Wnt 信号通路等密切相关；而这些与癌症途径、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、利什曼病、铂类耐药、麻疹、癌症中的转录失调、甲状腺癌、朊病毒病、细胞色素P450 对外源物质的代谢作用等密切相关［18-23］。其中PI3K/Akt 信号通路与肝纤维化的发展密切相关。PI3K 是与胞内信号传导相关的第二信使，由p85 调节亚基和p110 催化亚基构成的异二聚体，具有磷脂酰肌醇激酶和丝/苏氨酸激酶双重活性［24］。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一的Akt 是PI3K 下游的重要靶基酶。肝纤维化中TGF-β、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子及瘦素等可通过自分泌或旁分泌的方式对PI3K/Akt 通路产生影响。PI3K 诱导的Akt 活化可促进HSC 增殖活化［25］。网络药理学分析提示，黄芪汤对PI3K/Akt 信号通路具有调节作用，因此本研究进一步采用体外细胞实验验证黄芪汤对PI3K/Akt 信号通路的影响。

LX-2细胞是一种体外自活化的肝星状细胞。本研究以黄芪汤干预LX-2 细胞，结果发现黄芪汤可抑制HSC 活化标志物α-SMA 水平，降低Col-Ⅰ的表达，提示黄芪汤可抑制LX-2 细胞活化。进一步观察黄芪汤对PI3K/Akt信号通路的影响，结果发现黄芪汤可抑制LX-2细胞PI3K 表达，下调Akt 磷酸化水平。以上结果表明抑制PI3K/Akt 信号通路、抑制HSC 活化可能是黄芪汤抗肝纤维的部分作用机制。

综上所述，本研究通过网络药理学分析，发现黄芪汤抗肝纤维化具有多成分、多靶点、多信号通路特点。其中PI3K/Akt 信号通路可通过活化HSC，在肝纤维化发生发展中起重要作用。体外实验验证黄芪汤可通过调控PI3K/Akt 信号通路抑制HSC 的活化，从而起到抗肝纤维化的作用，这为发掘黄芪汤潜在作用机制提供了新的研究方向。