HPLC 同时测定三黄胶囊中11 种成分的含量

汪 健，金顺琪，2，黄 菲，张露蓉*

（1.南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215007；2.苏州市中西医结合医院，江苏 苏州 215101）

三黄胶囊是苏州市中医院的经典制剂（苏药制字Z04001094），其中包含大黄、黄芩、黄柏3 味中药，能够清热解毒，在用于治疗疮疡湿证，邪滞内阻肠道之证时，充分体现了吴门医派治“湿热”以“清热燥湿兼投并进”的治法。方中大黄主要含蒽醌类成分如大黄素、大黄酸等[1-2]，黄芩多含黄酮类成分如黄芩苷、汉黄芩素等[3-4]，黄柏主要含生物碱类成分如盐酸小檗碱[5-6]等，以上代表性成分分别是大黄、黄芩、黄柏含量测定中的指标成分，也是其发挥药效的主要活性成分，可作为药材质控标准的依据。

目前这三种单味药材，已分别建立了多种含量测定方法，但三黄胶囊仅有一篇测定其中盐酸小檗碱含量的报道[7]。含量测定作为药品质量评价的指标，凭单一成分是远不够的，因此，本实验综合2020 版《中国药典》及相关文献中对主要有效成分的含量测定，利用高效液相色谱法同时对三黄胶囊中11 种主要成分进行含量测定，进一步完善了三黄胶囊的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260 液相色谱系统（DAD 二极管阵列检测器）；纯水仪（Millipore 默克milli-q 公司）；超声波清洗机（南京先欧仪器制造有限公司）；电子天平（Mettler-Toledo 公司）。

1.2 试剂 甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司，批号：203194）；超纯水；无水乙醇（江苏强盛功能化学股份有限公司，批号：20211101）；磷酸（上海联试化工试剂有限公司）；标准品：盐酸小檗碱（批号：15062403）、黄芩苷（批号：18041007）、汉黄芩苷（批号：17010904）、黄芩素（批号：19112803）、汉黄芩素（批号：17012304）、大黄素甲醚（批号：16062404）购自上海纯优生物科技有限公司，纯度均大于98%；槲皮素（批号：081-9003）、大黄素（批号：110756-200110）、大黄酚（批号：110796-200310）购自中国药品生物制品检定所；芦荟大黄素（批号：110795-201710）、大黄酸（批号：110757-200206）购自中国食品药品检定研究院。

1.3 药材 三黄胶囊共10 批（批号：181107、190610、191211、200212、201030、201031、201101、201105、201106、220506），均源于苏州市中医医院。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 称取0.3 g 胶囊粉末，放于25 mL 容量瓶中，加入70%乙醇，使液面至刻度线，超声1 h，待放冷后，补足70%乙醇，摇匀、过滤即得。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱、黄芩苷、槲皮素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚这11种标准品，分别用甲醇配成浓度为418.36、544.80、100.58、110.66、7.93、4.70、9.02、15.56、15.04、27.74、10.85 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件 根据文献改良色谱条件[8]，考察不同条件下的分离效果，得到以下优化的色谱条件。色谱柱：Agilent Extend-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：pH 2.5 的甲醇-磷酸水溶液；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；波长：280 nm；进样量：10 μL。梯度洗脱条件如表1。供试品及混合对照品色谱图，见图1 和图2。

图1 供试品溶液图谱

图2 混合对照品溶液色谱图

表1 流动相梯度洗脱表

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 选择同一批次的三黄胶囊，按“2.1”中的方法提取样品，并在相同的色谱条件下检测6 次得到盐酸小檗碱、黄芩苷、槲皮素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，RSD 分别为0.17%、0.37%、0.55%、0.27%、1.24%、1.59%、1.74%、0.41%、0.37%、0.60%、0.30%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 选择同一批次的三黄胶囊，将制得的样品溶液分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 进样得到11 种化学成分的峰面积（同前），RSD 分别为1.92%、0.51%、0.43%、0.81%、1.88%、1.77%、0.73%、1.45%、0.71%、0.78%、0.97%，结果表明24 h 内供试品溶液具有良好的稳定性。

2.4.3 重复性试验 选择6 份同一批次的三黄胶囊，按同样操作制备样品溶液，并进样。计算得到11 种成分（同前） 平均含量的RSD 分别为0.89%、0.77%、1.10%、0.76%、0.84%、0.53%、0.98%、0.56%、1.50%、0.68%、0.84%，结果表明该方法重复性良好。

2.4.4 线性关系考察 用甲醇将配好的混合对照品按浓度由高到低稀释成5 份，把浓度（C）作为横坐标，峰面积（A）作为纵坐标，生成标准曲线（表2）。

表2 11 种成分的回归方程

2.4.5 加样回收率试验 分别把6 份已知含量的供试品与对照品溶液混合，进样，加样回收率结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

2.4.6 含量测定 取10 批三黄胶囊提取得到10份供试品溶液，进样，计算胶囊中各成分的含量（见表4）。

表4 样品含量测定结果（mg/粒）

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 应用甲醇和乙醇分别进行超声提取，结果显示（图3）得到的图谱峰型差异不大，其中乙醇提取的含量相对较高，并且考虑到乙醇较甲醇来说毒性低，危害小，故以乙醇作为提取溶剂。

图3 不同提取溶剂色谱图

3.2 色谱条件的选择

3.2.1 波长的选择 通过紫外全波长扫描后，选择比较波长为265 nm、280 nm、345 nm 时的色谱图（图4），当波长为280 nm 的色谱峰整体分离效果较好，峰面积相对偏大，所以将280 nm 确定为检测波长。

图4 不同波长的色谱图

3.2.2 pH 的选择 流动相方面选择了三个不同pH（pH=2.5、pH=3.0、pH=3.5） 的甲醇-磷酸水溶液，当pH 为2.5 的样品各峰分离效果相对较好，即用磷酸调pH 2.5 时最佳（图5）。

图5 不同pH 的色谱图

该实验建立了三黄胶囊中每味药的主要指标成分含量测定的方法，能够同时测定11 种主要指标成分，该法简便、稳定、可靠。结合前期建立的指纹图谱，可以全面控制该制剂质量，使其质量控制标准更加完尚。