肛周感染疾病来源肺炎克雷伯菌的分子特征及耐药性分析*

王玉婷,白永凤,陆军,程颖,杨云飞,祝进

(1.浙江大学医学院三系,杭州 310058;2.温州医科大学附属衢州医院＆衢州市人民医院检验科,浙江衢州 324000)

肛周感染是肛肠外科最常见的疾病之一,包括肛周脓肿和肛瘘。肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, KP)是革兰阴性杆菌,可在全身各部位引起一系列感染,是仅次于大肠埃希菌的肛周感染疾病条件致病菌。高毒力KP(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)是KP中的一类,易引起严重的侵袭性感染,且近年来更多的是与多重耐药相结合,为临床治疗带来了挑战。Yu等[1]通过一项关于hvKP感染疾病的调查中发现,hvKP可在肛周感染中检出。Jeong等[2]报道了1例侵袭性KP肛周感染的临床病例,预测其分离株可能为K1、K2血清型。近年来,关于KP分子特征的研究热点集中在血流感染、肝脓肿等疾病中,对于肛周感染来源的KP相关研究较为少见。目前,全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)技术已被广泛应用于病原菌的溯源和流行分析中[3]。本研究基于WGS技术,通过对肛周感染患者标本分离的KP进行分子特征分析,以期探明其分子病原学和流行病学特征。

1 材料和方法

1.1菌株来源及流行病学资料 回顾性分析2018年1月至2022年6月衢州市人民医院患者病历,并从中筛选病灶KP分离株46株,严格按照《全国临床检验操作规程》(第4版)[4]规定的方法分离培养和鉴定。纳入标准:所有患者经体格检查、磁共振或超声检查,均符合美国结直肠外科医师协会2016版《肛周脓肿、肛瘘和直肠阴道瘘临床诊治指南》诊断标准。排除标准:疑似污染菌株;合并肛周皮肤感染;发病前半年内有抗生素、激素用药史。纳入的临床病例资料显示,患者年龄为(44.3±13.8)岁,以40～64岁男性为主(56.52%,26/46)。多数患者(19/46,41.30%)合并有糖尿病,部分患者(11/46,23.91%)出现发热,80.43%(37/46)患者病程中出现CRP升高。另外,95.65%(44/46)患者进行了手术治疗,取得了较好的治疗效果。

1.2试剂与仪器 DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit(美囯Qiagen公司),K-B药敏纸片(英国Oxoid公司),阴性菌药敏板、MicroScan walkAway-96细菌鉴定药敏分析仪(德国西门子公司),MALDI Biotyper质谱鉴定仪(德国布鲁克公司),NanoDrop100超微量分光光度计(美国赛默飞世尔公司)。

1.3菌株鉴定及药敏试验 将所收集2018年1月至2022年6月衢州市人民医院肛周感染患者KP菌株分离培养后,调整菌悬液至0.5麦氏浊度,头孢曲松、左氧氟沙星、环丙沙星及头孢他啶/阿维巴坦使用K-B药敏纸片法进行药敏分析,使用MicroScan walkAway-96细菌鉴定药敏分析仪对其他临床常用抗菌药物进行药敏分析。判断标准:替加环素结果参照美国食品药品监督管理局(FDA)推荐标准[5],其他药物参照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)2021年标准。质控菌株:大肠埃希菌ATCC 25922,铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.4菌株DNA提取、测序和组装 菌株基因组的DNA提取按照QIAamp DNA Mini Kit说明书操作,使用NanoDrop100超微量分光光度计测定基因组DNA的纯度。全基因组测序委托杭州微数生物科技有限公司利用Illumin Hiseq2500平台完成。在Linux系统中运用shovill v0.9.0软件进行质量控制和序列拼接,并得到拼接结果的contig文件,采用prokka v1.14.6软件进行基因组注释,得到序列用于后期分析。

1.5全基因组分析 运用MLST v2.23.0软件将拼接后序列进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),得到46株菌的ST型;利用Kleborate v0.2.0软件进行分子血清型、毒力基因筛选,并通过毒力、耐药评分预测细菌毒力和耐药水平,具体评分规则参考文献[6];使用abricate v1.0.1软件将基因组序列与NCBI数据库对比,得到菌株的耐药基因;将二代拼接序列导入Ridom SeqSphere+v6.0.0软件,通过比对参照菌株K.pneumoniaesensulato基因组序列的2 358个核心基因,绘制最小生成树(MST)来分析菌株亲缘关系。

1.6数据整理与统计学分析 使用SPSS 24.0软件对数据进行整理和统计,计数资料均采用例数或百分比表示,分别使用在线网站iTol(http://itol2.embl.de/)绘制MST,Chiplot(https://www.chiplot.online/)制作热图,SPSSPRO(https://www.spsspro.com/)聚类分析。

2 结果

2.1药物敏感性试验 在46株KP中,CRKP菌株占4.35%(2/46),ESBLs耐药菌株占8.70%(4/46),全部KP对替加环素及多黏菌素敏感,其他临床常用抗生素耐药均小于25%。见表1。

表1 肛周感染疾病分离的46株KP的抗菌药物耐药率

2.2分子血清型的鉴定和MLST 基因组测序数据提示,46株KP分离株,基因组大小在5 200 454～5 953 516 bp之间,最大contig片段为1 482 322bp,contig数量最小为41。其中共检出14种K血清型,另有6株KP血清型未检出。其中K1血清型最多,占26.09%(12/46),其次为K2血清型(8/46,17.39%)。O抗原型和MLST分型分别检测出6种和25种,其中分别以O1型(28/46,60.87%)、ST23型26.09%(12/46)为主。K1血清型菌株与ST23型菌株完全重合,并且均表达O1抗原血清型。见表2。

表2 46株肺炎克雷伯菌的分子血清型及MLST分型结果

2.3肺炎克雷伯菌cgMLST分型及MST Ridom SeqSphere+v6.0.0软件将等位基因差异阈值为15的菌株定义为同一簇。在本研究中,46株KP经cgMLST分析形成的MST图显示,任意两菌株间等位基因最小差异为21个,均超出阈值(15个),菌株均没有成簇,菌株之间亲缘关系较远。但相对于其他未成簇菌株,12株ST23型KP的等位基因差异相对较小,亲缘相对关系较近。见图1。

注:基于2 358个cgMLST靶基因的序列分析的等位基因图谱。每个圆圈表示1个菌株,圆圈里的数字表示相应菌株的编号,圆圈的颜色指示ST型。连接线上的数字表示具有不同等位基因的靶基因的数量。

2.4KP毒力基因及耐药基因筛选 根据序列结果分析,在毒力基因中,有50%(23/46)KP菌株毒力评分≥4分,与铁摄取相关的基因Aerobactin(iucA、iutA簇)、Salmochelin(iroB、iroN簇)、Yersiniabactin(ybtS簇)的检出率分别为65.22%(30/46)、78.26%(36/46)及60.87%(28/46);基因毒素Colibactin共检出16株(34.78%);黏性调节相关基因rmpADC(rmpA簇)检出率为78.26%(36/46),rmpA2为56.52%(26/46)。大多数KP菌株耐药评分为0分(39/46,84.78%),2株CRKP菌株均携带blaNDM-1,其中1株同时携带blaKPC-2;共检出10株携带ESBLs 耐药基因菌株,4株ESBLs耐药菌株分别携带blaSHV-26、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14及blaCTX-M-27基因,6株未出现耐药表型。磷霉素耐药基因fosA6检测率最高,为73.91%(34/46),其他抗菌药物耐药基因检出率均较低。在各菌株与毒力、耐药基因的聚类分析中,可见46株KP可大体分为3簇,其中1簇为携带多毒力、少耐药基因菌株,占大多数(80.43%,37/46)。具体见表3及图2。

图2 46株KP毒力基因及耐药基因筛选结果热谱图

表3 46株KP毒力与耐药基因结果分析

3 讨论

肛周感染是指肛腺受到病原菌入侵而产生一系列症状的化脓性疾病,KP是其常见条件致病菌,可在机体免疫力下降时致病。本研究中,患者主要为男性,年龄(44.3±13.8)岁,与之前的研究报道基本相符[7]。此外,41.30%的KP感染患者伴有糖尿病,这与Liu等[8]报道一致,提示糖尿病可能是KP肛周感染的危险因素之一。

通过Kleborate及MLST软件分析,本实验中KP优势菌株为O1K1-ST23 KP,46株菌以K1、K2血清型为主,主要流行克隆为ST23及ST65,与之前报道的肝脓肿等其他来源hvKP优势血清型及ST型相一致[9-10]。本研究基于cgMLST对46株KP亲缘性关系进行溯源,构建的MST显示主要KP分离株分为2大分支,其中1支全部为ST23型KP。在46株KP中,2株KP间等位基因差异均超出15个基因的阈值,提示菌株没有成簇,亲缘关系较远,本地区KP菌株均为散发,未出现特定菌株流行。

hvKP大多携带多种毒力基因,但尚无统一判断标准,基于基因序列的毒力水平预测是较为可靠的判断方法。46株KP菌株中,半数被判定毒力评分≥4分。摄铁因子相关基因Aerobactin、Salmochelin、Yersiniabactin及高黏液表型基因(rmpA、rmpA2)均有超过50%的检测率。另有研究证实,rmpA及Aerobactin是hvKP有价值的预测因子[11]。Colibactin在所有O1K1-ST23 KP、O1K2-ST65 KP中均有检出,提示可能与ST型有一定的对应性。此外,有14株KP分离株携带全部5种关键毒力基因,分别为11株ST23、2株ST65和1株ST268,毒力基因与高毒力ST型一致。毒力质粒pLVKP是首次从hvKP CG43上分离得到的213 kb质粒,可直接影响hvKP毒力,其组成包括rmpA2、rmpA、iucA、iutA及iroB等[12]。本实验毒力质粒pLVKP 5种相关基因的组合类型中,rmpA+rmpA2+iucA+iutA+iroB基因组合检出率最高(54.35%,25/46),提示大多KP菌株可能存在毒力质粒pLVPK。目前,大量研究表明肝脓肿和血流感染是hvKP常见的感染类型。在衢州地区过去的研究中,对肝脓肿和血流感染的KP分离株均进行了rmpA、iutA、iroN、ybtS基因检测[13-14]。将本次结果与其比较可发现,肛周感染KP分离株4种毒力基因检出率与肝脓肿较为接近,比血流感染均相对更高。进一步提示该KP菌株可能与肝脓肿及血流感染类似,有较大的传播性和致病性。

目前临床上抗菌药物仍是该病治疗的主要方法之一,本次药敏试验结果结合耐药基因分析发现,多数KP对临床常用抗生素敏感。本实验中筛选出2株CRKP,其中1株同时携带blaNDM-1和blaKPC-2,但预测毒力水平较低。另1株不仅同时携带blaNDM-1和blaSHV-26,还检出了rmpADC、rmpA2、Aerobactin及Salmochelin4种高毒力基因,提示高毒力伴高耐药KP菌株在该院肛周感染患者中已经开始出现。本次研究中还发现4株产ESBLs菌株各携带1个相关耐药基因,但预测毒力水平较低。此外,本研究中磷霉素耐药基因fosA6携带率最高,但有学者表明,fosA6是KP染色体主要的fosA亚型[15],而KP染色体固有fosA亚型不会导致对磷霉素耐药。其他耐药基因携带率与其耐药表型较为一致。

综上所述,本院KP相关肛周感染患者大多为中年男性,合并糖尿病者易感。其KP分离株大多携带大量毒力基因,预测具有高毒力水平,虽大多对常用抗生素敏感,但已开始出现携带高毒力CRKP菌株,若一旦播散,将对临床是个极大的考验。因此,相关临床科室应提高重视程度,及早诊断和治疗,进一步加强监测,防止hvKP在本地区流行,预防高毒力耐药菌株的产生和播散。