雷帕霉素对短管赤眼蜂生物学特性的影响

王超，赵长江，唐子涵，陈诗思，张海燕

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）

雷帕霉素（Rapamycin，Rap）是一种新型大环内酯类抗生素，通过阻断细胞信号传导，阻滞细胞有丝分裂进程，从而发挥抑制作用，可能参与延缓卵巢的衰老，调控原始卵泡的激活和发育分化[1-2]。已有的研究表明，雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1），具有调控原始卵泡的激活和发育分化的作用，并且具有延缓衰老的作用，可以延长小鼠（Mus musculus）的寿命达10%～15%[3]。

20 世纪90 年代初，雷帕霉素的靶标（TOR）首先在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被发现[4]。TOR 是磷脂酰肌醇激酶相关激酶（Pikk）家族中的一种非典型丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于两个保守的复合体中，分别称为TOR 复合体1（TORC1）和TOR 复合体2（TORC2）[5]，它能促进细胞的生长和增殖[6]，是真核生物生长的主要调节因子，被认为是昆虫体内营养信号通路的主要组成部分。TOR 途径调控几个重要的生物学过程，包括mRNA 翻译[7]、核糖体生物发生[8]，营养代谢和自噬[9-10]。已有研究表明，在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的组织发育、新陈代谢、衰老、摄食行为、自噬和蛋白质合成中，TOR 途径都发挥重要作用[11-15]。在果蝇中，TOR 途径的抑制会导致幼虫果蝇和成年果蝇的身体尺寸减小，成虫前发育延长[16]。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）和美洲大蠊（Periplaneta americana）中，TOR 途径通过调节卵黄发生和保幼激素合成来促进生殖[17-18]。在褐飞虱（Nilaparvata lugens）中，TOR 途径通过卵黄发生调控其繁殖，NlTOR 的沉默会导致繁殖力下降[19]，近年来一系列的研究表明，TOR 途径在昆虫的生殖中具有重要的意义。但关于赤眼蜂中的TOR 途径研究还尚未见报道，甚至与赤眼蜂相关的信号通路研究也鲜有报道。

赤眼蜂是一种广泛应用于生物防治的鳞翅目害虫卵寄生蜂[20]，雄性由未受精的单倍体卵发育而来，而雌性由二倍体受精卵发育而来，这种孤雌生殖方式被称为产雄孤雌生殖（Arrhenotoky）[21]。一些赤眼蜂品系由于感染了Wolbachia，不经过交配产生受精卵就能产生雌性后代，并且雌性后代比率接近100%[22]，例如短管赤眼蜂（Trichogramma pretiosum），这种由Wolbachia 诱导的孤雌产雌生殖被称为完全孤雌生殖（Thelytoky）[23]。在生物防治应用中，完全孤雌生殖品系的赤眼蜂成本更低，防治效果更好，比产雄孤雌生殖具更高的应用价值。

研究以乙醇为助剂采用不同浓度的雷帕霉素连续饲喂产雌孤雌生殖的短管赤眼蜂3 个世代，观察统计各世代下不同浓度雷帕霉素处理后短管赤眼蜂的繁殖力（寄主卵变黑数）、羽化率（羽化出蜂的数量占变黑卵粒数的比值）、母代蜂存活时间（羽化后喂食雷帕霉素溶液存活时间）、发育周期（喂食雷帕霉素溶液24 h 后到子代羽化的时间）、子代蜂存活时间（羽化后不做任何处理的存活时间）及子代雄蜂比（子代雄蜂占子代总数的比值），以此来探究雷帕霉素处理导致的TOR 途径抑制对短管赤眼蜂的影响，为研究TOR 途径在短管赤眼蜂中的作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源

孤雌产雌品系短管赤眼蜂（Trichogramma pretiosum）由沈阳农业大学生物研究室提供，在黑龙江八一农垦大学养虫室恒温恒湿温箱中使用杀胚米蛾卵连续饲养多代，寄主米蛾在养虫室内用面粉、玉米粉、黄豆粉和麦麸繁育多代。研究所需的供试昆虫种群均在25±1 ℃，相对湿度70%±5%，光周期16 L∶8 D条件下连代饲养。

1.1.2 试验试剂

雷帕霉素（北京索莱宝科技有限公司），无水乙醇（辽宁泉瑞试剂有限公司），D-果糖（北京兰杰柯科技有限公司），葡萄糖（辽宁泉瑞试剂有限公司），蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 试验处理

收集24 h 内新鲜米蛾卵，使用60% 的阿拉伯树胶将米蛾卵粘在滤纸上制成米蛾卵卡。

试验开始前，根据说明使用无水乙醇溶解雷帕霉素，并添加用蒸馏水配置的40% 果糖加40% 葡萄糖溶液，配置成浓度为200、400、600、800、1 000 和2 000 μmol·L-1的雷帕霉素溶液，并以相同浓度梯度配置乙醇溶液（以下称乙醇对照组）。

试验分为13 组，每个处理取20 头新羽化的短管赤眼蜂（F0代），引入用牙签蘸取少量不同浓度雷帕霉素、乙醇溶液的指型管中，供赤眼蜂取食24 h 后接入杀胚15 min 的新鲜米蛾卵卡（约200 粒），24 h后将卵卡取出置于新的指型管中，放入25±1 ℃，相对湿度70%±5%，光周期16 L∶8 D 条件下连代饲养，待羽化后挑取未交配雌蜂，以同样方法继续饲喂200~2 000 μmol·L-1的雷帕霉素及乙醇溶液，进行F1和F2代的处理，以取食40%果糖加40%葡萄糖溶液为对照，试验重复3 次。

1.2.2 观察方法

处理后每8 h 观察一次短管赤眼蜂存活情况，记录存活时间。处理6 d 后，统计各指型管中变黑的卵粒数。每个处理随机选择10 个指型管，挑取20 个变黑卵粒置于新的指型管中，每隔8 h 观察一次统计羽化时间，羽化后每隔4 h 观察一次统计子代蜂寿命，挑取30 个变黑卵粒置于新的指型管中，羽化后统计单卵出蜂数及羽化率。其余10 个指型管待短管赤眼蜂全部死亡后使用体式显微镜根据触角形态和外生殖器观察鉴定雌性个体数。连续观察三代。

1.3 数据统计与分析

运用Excel 2019 进行数据统计，利用SPSS 26.0进行方差分析，方差分析使用Duncan 新复极差法。

2 结果与分析

2.1 雷帕霉素和处理世代对寄生量的影响

与糖溶液对照组相比，各世代中不同浓度雷帕霉素处理的携带Wolbachia 的短管赤眼蜂繁殖力均有不同程度降低，并且随着处理世代的增加降低程度逐渐加强（图1）。F0～F2代中各浓度雷帕霉素对雌短管赤眼蜂寄生力均存在抑制作用，但随着处理中雷帕霉素浓度的升高，对携带Wolbachia 的雌蜂寄生力的抑制作用逐渐减弱。与对照组相比，F0和F1代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后的寄生力均低于糖溶液对照组的寄生力，但寄生力差异不显著，分别为25.67～31.15 粒·头-1和24.89～30.78 粒·头-1。F2代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后的寄生力均低糖溶液对照处理后的寄生力，23.00～26.58 粒·头-1，且在400 μmol·L-1时差异显著，为23.00 粒·头-1，也是3 代中寄生力最低的雷帕霉素处理组。

图1 不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂寄生力的影响Fig.1 Effects of different concentrations of rapamycin on parasitism of Trichogramma pretiosum

2.2 雷帕霉素和处理世代对寿命的影响

对于雷帕霉素处理组，与糖溶液对照组相比，各世代中不同浓度雷帕霉素处理对雌蜂寿命的影响均偏向缩短携带Wolbachia 的短管赤眼蜂寿命，F0代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后雌蜂的寿命除2 000 μmol·L-1外均低对照组雌蜂寿命，为198.29～237.55 h，但差异不显著；F1代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后雌蜂的寿命除200 μmol·L-1外均低对照组雌蜂寿命，为131.63～193.89 h，且在400、600、800、2 000 μmol·L-1时差异显著，分别为145.20、143.47、131.63、163.82 h；F2代中雌蜂在200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后雌蜂的寿命除200 μmol·L-1外均低对照组雌蜂寿命，为184.20～214.20 h，但差异均不显著（图2）。

图2 不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂母代蜂寿命的影响Fig.2 Effects of different concentrations of rapamycin on the longevity of female generation of Trichogramma pretiosum

2.3 雷帕霉素和处理世代对发育历期的影响

与糖溶液对照组相比，各世代中不同浓度雷帕霉素处理对子代发育历期的影响均不显著（图3），F0代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后短管赤眼蜂子代发育历期为231.60～234.00 h，差异不显著；F1代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后短管赤眼蜂子代发育历期为237.60～245.70 h，差异不显著；F2代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素处理后短管赤眼蜂子代发育历期为233.63～238.74 h，差异不显著。在不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂子代发育历期的影响中糖溶液对照组在3 代间是存在显著差异的，短管赤眼蜂发育历期本身存在波动性。

图3 不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂子代发育历期的影响Fig.3 Effects of different concentrations of rapamycin on the development duration of offspring of Trichogramma pretiosum

2.4 雷帕霉素和处理世代对子代羽化率的影响

与糖溶液对照组相比，各世代中不同浓度雷帕霉素处理对携带Wolbachia 的短管赤眼蜂羽化率的影响具有很大的波动性（图4），在F1代中，400～1 000 μmol·L-1的雷帕霉素降低羽化率，其它浓度处理下羽化率均不低于对照组，但差异不显著；在F2代中，只有400 和2 000 μmol·L-1的雷帕霉素降低羽化率，其它浓度处理下羽化率均不低于对照组，但差异不显著；在F3代中，200～2 000 μmol·L-1的雷帕霉素均降低羽化率，且在400～800 μmol·L-1时差异显著，为80.00%、80.00%、85.00%。

图4 不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂子代羽化率的影响Fig.4 Effects of different concentrations of rapamycin on eclosion rate of offspring of Trichogramma pretiosum

2.5 雷帕霉素和处理世代对单卵出蜂数的影响

不同世代的糖溶液对照组子代单卵出蜂数在0.95～1.00 粒·头-1之间，无显著差异。各世代中不同浓度雷帕霉素处理对子代单卵出蜂数的影响均不显著（图5）。对于雷帕霉素处理组，F1～F3代取食雷帕霉素溶液的赤眼蜂寄生的米蛾卵单卵出蜂数在0.80～1.05 粒·头-1之间，F2代400 μmol·L-1时单卵出蜂数最少，为0.80 粒·头-1，F1代2 000 μmol·L-1时单卵出蜂数最多，为1.05 粒·头-1，但与对糖溶液照组相比差异均不显著（图5）。

图5 不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂单卵出蜂数的影响Fig.5 Effects of different concentrations of rapamycin on the number of Trichogramma pretiosum emerging from a single egg

2.6 雷帕霉素和处理世代对子代存活时间的影响

不同世代的糖溶液对照组子代平均存活时间在18.67～22.42 h 之间，无显著差异。对于雷帕霉素处理组，F0～F2代取食雷帕霉素溶液的赤眼蜂子代平均存活时间分别在20.59～25.00 h、16.74～19.55 h、18.75～21.67 h 之间，与糖溶液对照组相比差异均不显著。但值得注意的是，在F2代中，400、600、800 μmol·L-1相比于F1代短管赤眼蜂子代的存活时间显著缩短（图6）。

图6 不同浓度雷帕霉素对短管赤眼蜂子代存活时间的影响Fig.6 Effects of different concentrations of rapamycin on survival time of offspring of Trichogramma pretiosum

2.7 雷帕霉素和处理世代对短管赤眼蜂子代性别的影响

结果表明，雷帕霉素对短管赤眼蜂子代性别无影响，各世代中200～2 000 μmol·L-1浓度的雷帕霉素处理和相应浓度的乙醇处理短管赤眼蜂子代雌蜂占比均为100%，不存在雄蜂。

2.8 无水乙醇和处理世代对短管赤眼蜂寿命的影响

随着处理世代的增加，乙醇对短管赤眼蜂母代蜂寿命的影响呈现出缩短的趋势。与对照组相比，F0代各浓度乙醇处理下短管赤眼蜂母代蜂寿命为197.05～258.95 h，无显著差异；F1代各浓度乙醇处理下短管赤眼蜂母代蜂寿命为153.00～234.00 h，在200和2 000 μmol·L-1时差异显著；F2代各浓度乙醇处理下短管赤眼蜂母代蜂寿命为157.89～199.20 h，在600、800 和2 000 μmol·L-1时差异显著（图7）。

图7 不同浓度乙醇对短管赤眼蜂母代蜂寿命的影响Fig.7 Effects of different concentrations of ethanol on the life span of Trichogramma pretiosum

3 讨论

研究通过雷帕霉素处理的方式对短管赤眼蜂的TOR 进行抑制，探究雷帕霉素处理导致的TOR 途径抑制对短管赤眼蜂的影响，为研究TOR 途径在短管赤眼蜂中的作用机制提供理论基础。因为雷帕霉素极微溶于水，但溶解于有机溶剂，而雷帕霉素的常用溶剂二甲基亚砜（DMSO）经实验室前期研究证明，并不适合在赤眼蜂喂食相关试验中作为高浓度雷帕霉素的助剂，所以研究采用对短管赤眼蜂影响较小的乙醇作为助剂。

在果蝇的卵巢中，TOR 对生殖干细胞（GSC）和早期囊肿的增殖、维持和生长是必需的[24]，TOR 通路和InR 促进卵巢体细胞和生殖细胞系的增殖，而研究从繁殖力统计结果表明，TOR 的抑制会导致携带Wolbachia 的短管赤眼蜂雌蜂繁殖能力的降低。邓瑶[25]研究发现，TOR 基因的表达被抑制后，通过解剖并观察卵巢的发育发现，注射dsTOR 的白背飞虱（Sogatella furcifera）由于TOR 调控昆虫VG 和FOXO的表达，雌虫卵巢内不能形成卵，从而导致产卵被抑制；宋小平[26]研究表明，较高浓度的雷帕霉素会对玛雅臂尾轮虫（Brachionus urceus）的生殖产生不利影响，显著减少玛雅臂尾轮虫的子代数目，这种不利影响源自于高浓度的雷帕霉素会对TORC2 产生抑制性影响，这种影响会对生物体健康产生负面作用，研究中的结果均与之相符。

虽然研究的实验结果表明，TOR 的抑制会导致寄生力的降低，但是不能确定TOR 是唯一的因素，因前人使用抗生素处理携带Wolbachia 的短管赤眼蜂的研究中认为是抗生素去除了Wolbachia 或Wolbachia 滴度降低导致的寄生力下降。研究中高浓度抗生素并未去除携带Wolbachia 的短管赤眼蜂体内的Wolbachia，却得到相同结果（降低寄生力），所以认为除了TOR的影响外，在生殖力降低的效果中，抗生素本身引起的副作用是一个不可忽视的重要原因。并且对于第3代之后携带Wolbachia 的短管赤眼蜂雌蜂繁殖能力是否会继续降低，需要进一步证实。雷帕霉素引起的TOR 抑制对携带Wolbachia 的短管赤眼蜂子代羽化率影响具有代际间的波动性，且2 000 μmol·L-1以下各个浓度的乙醇都会对携带Wolbachia 的短管赤眼蜂子代的羽化和寿命造成影响。

在雷帕霉素刚被发现时，研究人员主要关注点是其作为免疫抑制剂的潜力[27]，在mTOR 途径被发现是酵母和线虫（Caenorhabditis elegans）的重要衰老调节因子后，才开始研究雷帕霉素的抗衰老能力[28-29]。研究是首次针对赤眼蜂寿命进行研究。雷帕霉素对于细胞自噬的调节是通过影响mTOR 通路实现，雷帕霉素可通过抑制TOR 诱导和促进细胞自噬并消除各种衰老蛋白来延长生物体的寿命，这在果蝇和蠕虫中已经得到证实[30-31]。但研究发现，雷帕霉素对携带Wolbachia 的短管赤眼蜂不具有延长寿命的效果，甚至在F1代的400、600、800、2 000 μmol·L-1时显著缩短短管赤眼蜂寿命，通过乙醇对照组对短管赤眼蜂寿命的影响，推测这是乙醇助剂引起的负面反应，排除助剂的影响，雷帕霉素应该具有延长携带Wolbachia 的短管赤眼蜂的作用。

研究中雷帕霉素处理后与携带Wolbachia 的短管赤眼蜂子代相关的各个指标，其中寄生力、羽化率和寿命影响较明显，其它指标包括子代发育历期、子代存活时间、性比和单卵出蜂数等，与助剂对照组相比均无显著差异，研究结果证明了雷帕霉素引起的TOR 抑制效果并不会遗传给子代。

4 结论

雷帕霉素对短管赤眼蜂具有降低寄生力、延长寿命、降低羽化率的作用；雷帕霉素对短管赤眼蜂发育历期影响不显著，并且不会改变孤雌产雌短管赤眼蜂的生殖方式；雷帕霉素对短管赤眼蜂母代蜂的影响不会遗传给子代。