光催化反应中活性氧物种产生及抗菌机制研究

王鹏鸽，张 静，王震宇，赵宇蕾，黄 宇*

1.中国科学院地球环境研究所 黄土与第四纪地质国家重点实验室，中国科学院气溶胶化学与物理重点实验室，西安 710061

2.西安地球环境创新研究院，西安 710061

细菌等有害微生物感染引发的流行性疾病仍是日益严重的全球健康问题，结核分枝杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和炭疽杆菌等都是世界上最致命的细菌，每年都有数万人因细菌感染而死亡（Zhou et al.，2021）。加强对公共区域的消毒灭菌对于阻断细菌、病毒等的传播具有至关重要的积极意义（唐玫，2016）。目前，传统的环境消毒杀菌技术多采用含氯试剂、过氧化氢（H2O2）、臭氧（O3）氧化和紫外光照等方法，存在时效短、用量多、本身或副产物危害周边环境，且易产生抗药性等问题（李灵灵等，2019）。

光催化微生物灭活技术作为一种广谱高效、安全稳定、持久耐热、不易产生耐药性、杀菌彻底的方法受到广泛关注（张慧书和刘守新，2009；李灵灵等，2019）。目前，TiO2、ZnO、CuO、GO、g-C3N4、MoS2、BiFeO3、Ag /AgBr、ZnFe2O4等不同类型的光催化材料被广泛用于微生物杀灭研究（Hou et al.，2012；Li et al.，2012；马建中等，2014；Parham et al.，2016；李灵灵等，2019；Daub et al.，2020；Mei et al.，2020；Nichols and Chen，2020；Zhao et al.，2020；Su et al.，2021），涉及的微生物包括大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、沙雷氏菌属菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、霍乱沙门氏菌、白色念珠菌、脊髓灰质炎病毒等（Wang et al.，2015；Daub et al.，2020）。研究表明，光催化反应中产生的活性氧物种（ROS）在光催化抗菌中发挥着不可替代的作用（Rojas-Andrade et al.，2017）。ROS 具有较高的电子亲和能和强氧化性，能够直接作用于细胞壁/膜或在生物系统中造成氧化损伤实现抗菌作用（Zhao et al.，2020）。Li et al.（2012） 和Zhang et al.（2013）的研究都表明羟基自由基（· OH）、超氧自由基（· O ）、H2O2等作为主要的活性物种参与大肠杆菌等的光催化抗菌过程，ROS 的总浓度与其抗菌效果呈线性相关。然而，光诱导不同种类ROS 的具体杀菌过程和作用机制的研究较少，尚未有相关综述对其过程进行系统阐述。

1 光催化反应中ROS 产生机制

光催化反应一般分三个基本步骤发生：形成电子和空穴对、电子和空穴对分离到光催化剂表面、催化剂活性位点发生光还原和光氧化反应。即：具有一定能量的光照射到半导体表面时，其内部电子和空穴发生分离，价带（VB）中的电子（e-）被激发至导带（CB），在VB 中留下带正电的空穴（h+），产生的载流子（e-/ h+）迁移到催化剂表面，VB 中的h+与CB 中的e-具有氧化性和还原性，能够与周围环境中的水（H2O）和氧气（O2）等含氧物质发生氧化还原反应，生成以· OH、、1O2（单线态氧）和H2O2等为代表的ROS（Li et al.，2012；Nosaka and Nosaka，2017；Daub et al.，2020），如图1 所示。因此，光催化反应过程中ROS 的产生与半导体的电子结构以及其氧化还原电势（EH）有关。不同半导体能带上h+和e-的氧化还原电势不同，根据不同半导体的价带势（EV）、导带势（EC）和EH的位置关系，可以从热力学上基本确定ROS 的产生类别，表1列出了几种常见半导体的EC、EV和Eg（禁带宽度）。另外，光催化反应生成ROS 的过程是一种界面反应，表面反应支配着光催化转化的整个过程，除了能带结构外，催化剂表面的吸附性能等也应作为影响ROS 生成的重要因素。

表1 几种光催化半导体材料Eg、EC 和EV 值Tab. 1 Band gap, conduction and valence band edge energies for several photocatalysts with respect to NHE

图1 光催化氧化还原H2O 和O2 产生ROS 机制示意图（Nosaka and Nosaka，2017）Fig. 1 Reactive oxygen species generated in the photocatalytic reduction and oxidation steps of oxygen and water(Nosaka and Nosaka, 2017)

1.1 超氧自由基

在溶液体系中，由于催化剂和水溶液的界面内形成空间电荷层，即亥姆霍兹层，半导体的能带边受体系pH 的影响会向更高或更低的能级转移，因此根据带边位置判定ROS 种类时应考虑到半导体能带在溶液中的实际氧化还原电势。根据Nerstian 方程，不同pH 溶液中ECB和EVB的计算如式(3)、式(4)（Li et al.，2012）：

式中：PZZP指材料等电点。Li et al.（2012）以2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-甲酰苯胺（XTT）、对氯苯甲酸和糠醇作为、· OH和1O2指示剂，通过紫外吸收和液相色谱法对7种金属纳米氧化物分散液在紫外（365 nm）光照48 h 后产生ROS 进行了定量研究，发现产生的总ROS（· OH、、1O2）平均浓度为nTiO2＞nZnO＞nAl2O3＞nSiO2＞nFe2O3＞nCeO2＞nCuO；其中，nZnO 在紫外光照下产生的浓度最高，其次为nFe2O3、nTiO2、nCeO2，这与不同金属氧化物CB 在溶液中的实际还原电势有关。在pH = 5.6 溶液中，nTiO2和nCeO2的校准ECB分别为- 0.28 eV和- 1.69 eV，负于（- 0.2 eV），因而能够直接给O2提供电子产生。而nZnO 和nFe2O3的校准导带电位（- 0.12 eV 和0.46 eV）虽正于，但由于二者为n型半导体，溶液中亥姆霍兹层的空间电荷区域内正电荷积累，导带向上弯曲，因此其实际导带电位负于，使其能够产生。nCuO 的CB 电位（0.69 eV）不足以还原O2，而nAl2O3和nSiO2的Eg值均大于3.4 eV，不能被激发，因此无产生。王大彬等（2015）使用鲁米诺作为化学发光探针，采用连续流动化学发光法在线定量检测TiO2光催化产生· O 的过程，发现TiO2产生的浓度及其化学发光强度受到体系pH 影响，的生成随pH 值升高而增加，主要原因可能与TiO2的表面形态变化影响表面光生电子的传递和O2吸附等有关。假设的生成是一个零级反应，而转化过程符合准一级反应，TiO2光催化反应生成的浓度随时间变化过程如式(5)所示：

式中：[· O ]为时间t时溶液中· O 的浓度，y0为t0时的浓度，kf为的生成速率常数（实验中为0.0653 nmol · s-1），kd为转化速率常数（实验中为0.00266 s-1），进一步计算得到光催化反应中的半衰期（t1/2= ln 2 /kd），约为260 s。

另外，材料对O2的吸附能力会直接影响· O的生成。Buchalska et al.（2015）比较了金红石相（γ-TiO2）、锐钛矿相（α-TiO2）和二者复合（γ-TiO2/α-TiO2）的光催化活性，发现由于γ-TiO2表面对O2的吸附能力较强，激发电子的氧化还原电位较低，产生· O 的效率更高。

1.2 羟基自由基

在光催化诱导生成的ROS 中，· OH 是活性最高的自由基之一。· OH 可以通过表面H2O 或OH-氧化、质子化后还原等多种途径产生（式(6) — (10)），一般认为VB 中h+氧化是· OH 的主要来源（李国亭等，2012；县涛等，2013；Nosaka and Nosaka，2017）。赵洪霞等（2017）通过电子顺磁共振（EPR）自旋捕捉和自旋标记技术研究了光照下几种纳米金属氧化物在磷酸缓冲溶液（PBS，pH = 5.6）中产生ROS 的过程，表明nTiO2产生· OH 的信号强度明显高于nCuO，主要是因为nTiO2的价带电位（2.97 eV）高于nCuO的价带电位（2.39 eV），因此nTiO2的氧化性更强更容易产生· OH。在Li et al.（2012）的研究中，体系pH为5.6 时，nCeO2价带电势为1.6 eV，低于· OH 的氧化还原电势，不能产生· OH，而nTiO2、nZnO、nCuO 以及nFe2O3的校准价带电势（2.92 eV、3.08 eV、2.39 eV 和2.66 eV，式(5)）均高于· OH（2.2 V，vs. NHE），因此能够通过h+氧化H2O 生成· OH，其中，nTiO2产生· OH的浓度最高达(19.3 ±0.8) μmol · L-1，分别是nZnO 和nFe2O3的2 倍和6 倍。

光催化反应中· OH 是由催化剂表面的OH 基团产生的，因此，催化剂晶体结构和表面化学状态会影响· OH 的产生。在TiO2等金属氧化物的表面，氧原子的位置可以分为两种不同的配位类型，即末端OH（）和桥接OH（），OH 不能发生光氧化反应（Salvador，2011；Nosaka and Nosaka，2017）。Murakami et al.（2007）利用激光诱导荧光技术（LIF）成功检测了不同类型TiO2粉体在UV 照射下表面· OH 向气相中扩散的过程，表明· OH 信号来源于表面羟基或H2O 与光生h+之间的反应，这种· OH 能够从固体表面扩散到0 —8 mm 远的气相空间，扩散时间随TiO2粉末种类的不同而变化，并受热处理温度的影响，其中混相（P25）和金红石相TiO2产生· OH 的量高于纯锐钛矿相，光催化生成并从TiO2表面释放的· OH 的量子产率约为5×10-5。Zhang and Nosaka（2015）采用荧光探针法研究了在470 nm 的LED 光照下WO3产生· OH 的过程，· OH 在WO3悬浮液中的表观量子产率为3.4×10-4，加入Fe3+之后，其产率明显提高。这是因为WO3的导带底电位较低不足以使O2还原，Fe3+的加入消耗了光诱导e-，抑制e--h+的复合，促进· OH 转化。

1.3 过氧化氢

H2O2的生成有两种途径，即O2的2e-还原和H2O 的2h+氧化（Nosaka and Nosaka，2017）。由于的反应活性低，还原途径在H2O2的产生过程中占主导。由· O 生成H2O2的过程有两种途径，一种是单电子还原物种的歧化反应，如式(11)，另一种是光诱导CB 中e-还原，如式(12)。对于第二种情形，可通过锐钛矿TiO2(101)表面吸附的密度泛函理论计算得到其非绝热反应势垒为0.3 eV（Li and Selloni，2013）。Kakuma et al.（2015）发现在间歇式光催化反应中，锐钛矿TiO2产生H2O2的量要高于金红石相，原因可能是锐钛矿TiO2在生成过程中会迅速达到一种稳定状态，由此表明· O 的转化是H2O2的来源之一；在锐钛矿中可观测到的产量较低，原因可能是· O 快速转化成H2O2。Nosaka and Nosaka（2017）使用连续流动化学发光法在线检测紫外辐照纳米TiO2悬浮液中的活性氧过程中发现，H2O2的产量为金红石＞P25＞锐钛矿，同时三种纳米颗粒产生· O 的量基本相同。以上研究表明H2O2的产生除了通过途径，还可通过H2O 氧化产生，即式(13)所示。H2O 的2h+氧化生成H2O2的过程可分为两步进行：H2O 氧化生成· OH（式(14)）和· OH 聚合化（式(15)）：

王大彬等（2015）采用连续流动化学发光法对TiO2光催化产生的H2O2浓度进行在线测试，发现体系pH 对产生H2O2的影响与· O 类似，TiO2光催化产生H2O2的过程符合指数衰减函数增长，该方法测得TiO2光催化产生的H2O2浓度范围为0.60 — 3.0 μmol · L-1，进一步推导得到TiO2光催化反应中H2O2的浓度随时间变化的函数为：

式中：[H2O2]为H2O2浓度，kf为H2O2的生成速率常数，kd为H2O2的转化速率常数。计算得到H2O2在TiO2光催化反应中的生成速率常数为15.0 nmol · s-1， 半衰期约为131 s。H2O2从TiO2粉体表面扩散到空气时，量子产率为1.4×10-7和1.8×10-7（Kubo and Tatsuma，2004；Kubo et al.，2004）。由于H2O2自身相对稳定，所以在光催化反应中H2O2寿命短的原因可能是容易受到其他活性高的物种攻击而分解，这也解释了H2O2在光催化反应中浓度较低的原因（王大彬等，2015）。

1.4 光催化产生ROS 的影响因素

根据前文ROS 生成过程的研究结果，不同半导体EV、EC和特定种类自由基EH的位置关系直接影响ROS 的生成，除了已提及的半导体的能带结构、体系pH、催化剂晶体结构、表面吸附性能以及表面化学状态等因素，催化剂属性和反应条件（外加光源等）对光催化产生ROS 的种类和浓度也具有显著的影响。

（1）催化剂的形貌、尺寸、表面形态等直接影响能带结构和ROS 的产生。Rosales et al.（2019）研究了一维（1D）TiO2纳米结构中形貌的影响，特别是纳米管（TNT）、纳米纤维（TNF）、纳米棒（TNR）和纳米线（TNW）对ROS（· OH和1O2）的光生成及其对光催化活性的影响，发现ROS 产量为TNF＞TNT＞TNR＞TNW，其中TNF 具有更强的光致发光发射光谱信号，氧空位（Ov）相关的表面缺陷浓度更高，表明ROS 的产生与TiO2纳米材料形貌有关。Li et al.（2012）对比了纳米级和块状TiO2、ZnO 等在紫外光照下产生· OH、以及总ROS 的情况，发现纳米粒子产生ROS 的浓度明显高于块状材料，是因为纳米级半导体比块状材料具有更大的比表面积，从而产生更多的活性位点促进ROS 生成。Waiskopf et al.（2016）根据半导体-金属杂化理论制备了CdSe/CdS-Au 纳米棒，通过量子尺寸效应发生能量转移促进· OH 的生成。Huang et al.（2019）通过构建g-C3N4/ TiO2异质结，促进体系在可见光照下产生· OH。Daub et al.（2020）构建了Ag@TiO2核壳结构，与原始TiO2相比，Ag@TiO2纳米颗粒的带隙更小，在可见光下更易产生ROS。

（2）反应体系中外加光源影响光催化产生ROS 的种类和浓度。Ishibashi et al.（2001） 研究了TiO2薄膜在H2O 界面产生ROS 的光强依赖行为，发现在15 mW · cm-2和50 μW · cm-2时H2O2的量子产率分别为2.8×10-4和2.1×10-3。Ma et al.（2012）在太阳模拟器中研究了不同太阳光谱对TiO2纳米粒子产生ROS 的影响，发现去除UV-B（280 — 320 nm）和波长低于400 nm 波谱段对TiO2纳米粒子光催化ROS 生成无显著影响，而去除UV-A（320 — 400 nm）则显著降低了ROS 生成。

2 光催化反应产生ROS 的检测

光催化过程中产生的ROS 主要通过振动谱学技术、紫外 - 可见分光光度技术、荧光发射技术等对其进行定性或定量检测（Nazarewicz et al.，2013；Hayyan et al.，2016；Toor and Sikka，2019）。电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技术可以较为直接地用于光催化过程中· O 以及· OH 的定性以及定量测定。5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide，DMPO）、5-(二乙氧基磷酰)-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5-diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide，DEPMPO）、5-叔丁羧基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide，BMPO）、5-(2,2-二甲基-1,3-丙氧基环磷基)-5-甲基-1-吡咯啉N-氧化物（5-(2,2-dimethyl-1,3-propoxy cyclophosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide，CYPMPO）均可作为· O 和· OH的捕获剂，另外DMPO 的衍生物，如N-叔丁基-α-(4-吡啶基-1-氧)-硝酮（N-tert-butyl-α-(4-pyridyl-1-oxide)nitrone，POBN）也可作为· OH的捕获剂。Dai et al.（2016）通过一步水热法合成Ce 掺杂的Bi2MoO6，并通过DMPO 捕获技术对体系中产生的·和· OH 进行研究。不同捕获剂与· O 以及· OH 发生反应的速率常数及相应自由基加和物的半衰期见表2。另外，紫外 - 可见分光光度技术以及荧光显色技术均可实现·、· OH 以及H2O2的检测。Huang et al.（2015）采用化学沉淀法合成BiOBr-BiOI 复合光催化剂，通过分光光度法，以氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）作为显色剂，研究了复合材料光催化过程中产生的· O ，并通过化学荧光技术，以对苯二甲酸（terephthalic acid，TA）作为荧光探针，对复合材料光照过程中产生的· OH 进行分析。常用的ROS 显色剂以及荧光探针见表3。

表3 分光光度法以及荧光法中常用的活性氧物种显色剂以及荧光探针Tab. 3 Chromogenic agents and fluorescent probes used in spectrophotometry and fluorescence methods for ROS detection

不同测试方法以及相关反应物（捕获剂、显色剂、荧光探针）的选择对ROS 的定性测试、定量测试以及灵敏度具有一定影响。如DMPO 与加合物的半衰期为0.9 — 1.3 min，寿命较短，且随着时间的延长，DMPO-加合物会转变为DMPO-· OH 加合物，因此不利于的捕获及检测（Hawkins and Davies，2014）。Roubaud et al.（1997）以 DEPMPO 作为捕获剂，对黄嘌呤在光照过程中产生的· O 进行了定量测试，并将该方法的定量结果与基于细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）还原的分光光度法进行对比发现：当黄嘌呤的浓度为10 — 20 μmol · L-1时，10 mmol · L-1的DEPMPO 与加和物的量相当于60% — 70%Cyt-C 与的反应产物；当黄嘌呤的浓度为5 — 10 μmol · L-1时，两种测试方法对于的定量结果一致；当黄嘌呤浓度低于1 μmol · L-1时，基于Cyt-C 的分光光度法已无法检测体系中产生的· O ，而采用DEPMPO 作为捕获剂可以测试材料浓度低至0.025 μmol · L-1时体系中产生的·。因此在该体系中，基于DEPMPO 的EPR 技术的灵敏度是基于Cyt-C 分光光度法的40 倍；但当体系中自由基浓度大于10 μmol · L-1时，基于Cyt-C的分光光度法可以测试体系中100%的·，而DEPMPO 只能捕获60% — 70%的·。

3 光催化反应产生ROS 的抗菌机理

3.1 超氧自由基杀菌机制

Xiao et al.（2020）通过在花粉骨架（rape pollen）载体上原位沉积有缺陷的MoS2纳米片，制备了亲水性生物复合光催化剂PM3，并对其光催化作用中产生的ROS 杀菌机理进行了深入分析。MoS2纳米片作为载流子，其表面缺陷的形成可以有效降低电子与空穴的复合效率。在可见光照射下，该复合材料对大肠杆菌的抗菌效果达90%（图2a）。利用重铬酸钾、草酸钠、异丙醇、哌啶醇氧化物（4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基，TEMPOL）、Fe(Ⅱ)-EDTA 以及组氨酸（L-histidine）分别作为 e-、h+、· OH、·、H2O2、1O2的牺牲剂，对抗菌过程中主要的活性物种进行研究，表明e-，h+以及·为主要的抗菌活性物种（图2b、2c）。进一步对胞内的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及过氧化氢歧化酶（hydrogen peroxide dismutase，CAT）的活力进行研究，发现胞内抗氧化酶在30 min 内逐步增强，随后其活力下降。抗氧化酶活力的增加表明大肠杆菌细胞在面对ROS 的氧化损伤时启动了自我保护行为（Castro-Alférez et al.，2017；Xiao et al.，2017）。但是随着ROS 的累积，两种酶被破坏。破坏酶系统后，活性物种开始攻击细菌的细胞膜。细胞膜主要有脂质和蛋白质构成，可以选择性地进行离子渗透，同时负责能量依赖的反应，如ATP 合成、离子运输和代谢（Hurdle et al.，2011；Sun et al.，2016）。通过2,3,5-三苯基四唑氯（2,3,5-triphenyl tetrazolium，TTC）研究细胞呼吸过程表明：随着光照时间的增加，细胞的呼吸作用以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的生成量均明显下降。这是由于细胞膜构象破裂导致电子传递链短路而引起的。但是ATP 的降低速率随着光照时间的延长逐渐降低，主要由于ATP 可以暂时用于膜修复和跨膜电位的维持，因此初始阶段其下降速率较快。这与初始光照时，材料的抗菌性能较弱、抗氧化酶的活力较强具有明显的相关性。以细胞膜为界的细菌能量代谢系统（ATP合成能力和细胞呼吸链）受损后，细胞膜电位无法维持，说明细菌细胞膜在能量代谢功能水平上的损伤。进一步地，脂质体是细胞膜流动性以及渗透性的主要原因，脂质中的氢原子具有较强的反应活性，可以接受外援ROS 的电子，转变为自由基形式，并进一步被分解，形成链式反应。脂质过氧化（lipid peroxidation，LPO）是饱和以及不饱和脂质被氧化的标志，进一步通过脂质过氧化检测从膜结构层面探讨膜损伤过程，揭示ROSs 如何作用于细菌膜，导致膜解体，结果表明：30 min 内随着光照时间的延长，LPO 生成量增加，说明双分子层膜的扩散能力降低并被损伤。脂类分子发生重排，在氧化链反应下进一步攻击膜蛋白，导致磷脂双分子层破碎，膜束缚功能受损，非特异性通透性增加。同时，随着光照时间的延长，K+的泄漏量逐步增加，SEM 结果显示：在处理20 min后，膜的粗糙度增加并出现凹坑；40 min 时，可观察到细胞膜出现空洞和分解现象；60 min 时，细胞被彻底破坏，形态混乱。进一步表示由于代谢崩溃而导致膜完整性受损。因此，ROS 是通过细胞膜中脂质以及蛋白质的氧化，破坏这些分子的构象结构和物理化学性质，导致细菌细胞膜在能量代谢功能水平上以及机械结构功能水平上的双重损伤。蛋白质羰基（protein carbonyl，PC）是最常用的蛋白质氧化标记物，它是通过ROS 的攻击，将蛋白质的几种氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、脯氨酸或组氨酸）上的侧链胺基转化为羰基而形成。Xiao et al.（2020）发现PC 浓度随着照射时间的延长而升高，说明蛋白被入侵的ROS 氧化；同时还观察到反应过程中，DNA 和RNA 迅速释放，说明遗传系统完全断裂，对细菌造成不可逆转损伤，最终导致细胞死亡。PM3 复合材料的抗菌机制如图2e所示。

图2 PM3 对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌和短小芽孢杆菌的光催化杀菌性能（可见光照，光强1000 W · m-2）（a）；可见光辐照下，加入不同活性物种牺牲剂后，PM3 的抗菌性能（b）；可见光辐照及黑暗条件下PM3 复合材料的· O ESR 谱图（c）；超氧化物歧化酶与过氧化氢酶活性随反应时间的变化（d）；PM3 复合材料在可见光照射下的细菌灭活机制（e）（Xiao et al.，2020）Fig. 2 Photocatalytic inactivation toward P. aeruginosa, S. aureus, and B. pumilus by PM3 under VL irradiation (1000 W · m-2) (a);VL-driven photocatalytic inactivation of E. coli by PM3 biohybrid with different scavengers (b); ESR spectra of superoxide radicals of PM3 biohybrid under VL irradiation and dark (c), SOD and CAT activity (d); proposed bacterial inactivation mechanism by the PM3 biohybrid under VL irradiation (e) (Xiao et al., 2020)

3.2 羟基自由基杀菌机制

· OH 是ROS 中氧化能力最强的活性物种，其氧化电势为2.78 V（vs. NHE），高于其他常用的强氧化剂，如O3（2.07 V）、H2O2（1.77 V）、KMnO4（1.54 V）、Cl2（1.36 V）。Hou et al.（2012）研究了Ag /AgBr / TiO2纳米管对大肠杆菌的抗菌性能，通过ESEM、TEM 和FTIR 等直接观察细胞壁和细胞膜的损伤过程，并通过检测K+泄漏进一步证实在光电催化反应过程中，· OH 作为主要的活性氧物种协同· O 、光生h+和Br0等对细菌内外发生氧化攻击致其细胞壁和细胞膜损伤，实现光催化抗菌。

Zhang et al.（2020）合成了含氧空位和碳包覆层的WO3-x/ C，从分子水平上对大肠杆菌的光热杀灭过程进行研究，如图3 所示。表明氧空位和碳包覆使WO3-x/ C 在红外区有较强的吸收，提高了载流子分离效率。WO3-x/ C 可以通过光热协同作用在40 min 内，光强为2000 W · m-2时使大肠杆菌在红外光下完全失活，随着反应时间的延长，荧光实验中死细胞数量逐渐增加，反应120 min 时，细菌被完全杀灭。由于细胞自身防御系统启动，CAT 逐渐增加，反应进行到60 min时，大肠杆菌的失活占主导地位，导致CAT 活性迅速下降，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SOD 以及LPO 均出现相似的变化过程。MDA 是细胞膜脂质过氧化的主要产物，可用于间接测定膜系统损伤程度。· OH 与生物膜、酶和膜受体相关侧链中的磷脂发生反应，改变细胞膜的流动性和通透性。同时随着反应时间的延长，TTC 生成量逐渐降低，表明细胞膜的呼吸作用下降，同时检测到K+和PC 的泄露量分别从0 mg · L-1增加到0.16 mg · L-1和0.15 mg · L-1，表明细胞膜受损，在260 nm 处检测到DNA 以及RNA 的泄漏量也不断增加。Du and Gebicki（2004）通过γ 射线辐照产生· OH，结合铁二甲酚橙分析法研究了U937 细胞与· OH 作用过程中的初始细胞靶点，发现小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14 和U937 细胞暴露于· OH 中时，产生了蛋白质过氧化物，但未检测到明显的脂质过氧化以及DNA 损伤。在受照射的细胞中，蛋白质过氧化物的产量与培养基的成分无关，表明只有细胞内或细胞表面附近产生的自由基才能有效地氧化细胞蛋白质。因此在· OH 与细胞作用过程中蛋白质是· OH 的主要初始靶点。

图3 大肠杆菌K-12（2×107 cfu · mL-1，50 mL）在WO3 - x / C（20 mg）存在下的不同时间段的红外辐射荧光光谱图（a — e）；过氧化氢酶活性随时间变化图（f）；MDA、LPO 以及SOD 的生成量（g）；细胞呼吸过程中TTC 活性变化（h）；K+以及蛋白质羰基的泄漏量随时间变化图（i）；DNA 和RNA 的泄露量随时间变化图（j）；光热协同作用下，WO3 - x / C 的抗菌机理（k）（Zhang et al.，2020）Fig. 3 Fluorescence microscopic images of E. coli K-12 (2×107 cfu · mL-1, 50 mL) in the presence of WO3 - x / C under IR irradiation (a — e); CAT activity (f); content of MDA, LPO, and SOD (g); TTC activity during cellular respiratory (h);the amount of K+ leakage and protein carbonylation (i); leakage of DNA and RNA content (j);mechanism of E. coli inactivation with WO3 - x / C under infrared light irradiation (k) (Zhang et al., 2020)

3.3 过氧化氢杀菌机制

H2O2在光催化ROS 中的氧化能力（1.77 Vvs.NHE）仅次于· OH，相较于短寿命的· OH和·，H2O2性能更稳定。但H2O2一般作为· OH 和·的副产物，直接将其作为光催化ROS 的抗菌研究较少。Thurston et al.（2020）制备了具有可见光响应的石墨相氮化碳/聚乙烯醇（g-C3N4/ PVA）复合水凝胶，在可见光照（400 ≤λ≤800 nm）下，6.7% 的g-C3N4/ PVA 水凝胶能够以0.9 —2.5 μmol · L-1· min-1的催化速率生成H2O2，显著降低浮游细胞群存活率，减少铜绿假单胞菌生物膜形成。H2O2易于在酸性介质的溶酶体发生作用，导致溶酶体的脂质过氧化，使溶酶体膜发生透化作用，进而导致细胞的凋亡（Jannesari et al.，2020；Rodríguez-González et al.，2020）。

4 光催化抗菌性能评价方式

体外抗菌实验可用于筛选抗菌材料是否具备抗菌能力，也可以用于测定微生物对材料的敏感性，通常先用抑菌环法做定性判断，后用最低抑菌浓度进行定量评价。针对光催化杀菌过程，《GB / T 23763—2009，光催化抗菌材料及制品抗菌性能的评价》（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会，2010）以及《GB / T 30706 — 2014，可见光照射下光催化抗菌材料及制品抗菌性能测试方法及评价》（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会，2014）对不同光源下的光催化抗菌材料及其制品的抗菌性能的评价方式做了详细规定，此处不再赘述，主要从定性和定量两种评价方式对光催化抗菌材料的性能进行评价。

4.1 纳米光催化材料抗菌性能的定性评价——琼脂扩散法

纳米光催化材料体外抗菌性能的定性评价可通过多种临床微生物学方法进行，其中主要采用纸片扩散法、肉汤稀释法或琼脂扩散法。琼脂盘扩散法通常用于快速分析常见微生物的生长，如细菌、真菌和酵母，如图4 所示（Guerrero Correa et al.，2020）。在这种方法中，将标准浓度的微生物接种到含有生长培养基的培养皿上，并在琼脂表面放置有抗菌剂的滤纸片。培养皿在适当的生长条件下培养，并根据纳米材料特性选择光源处理，将所述抗菌剂涂抹在琼脂平板上，形成相应的抑菌带，观察抑菌带的大小，判断材料的抗菌性能。

图4 琼脂扩散法测定材料抗菌抑菌性能（a）；琼脂稀释法测抗菌材料的MIC 值（b）（Guerrero Correa et al.，2020）Fig. 4 Scheme of the agar disk diffusion method (a); scheme of the agar dilution method for MIC determination (b)(Guerrero Correa et al., 2020)

4.2 纳米光催化材料抗菌性能的定量评价——琼脂扩散法

最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）是指材料完全抑制某种微生物生长的最低浓度（马绪荣和苏德模，2000）。琼脂稀释法可用于定量测定抗菌材料抑制微生物生长的能力，即MIC 值。MIC 值越小，抗菌剂的抑菌活性越大。琼脂稀释法有两种方法：（1）液体稀释法。用营养液将材料按两倍稀释成系列浓度，依次分装在一系列实验管中，于各实验管内加入相同浓度的实验用菌，依据光催化材料的性能进行适当的光照处理，经过一定时间和温度的培养（常用37℃，24 h），以不含抗菌剂的菌液作为对照组，实验管中营养液初现澄清对应的材料浓度即抗菌材料的MIC。（2）固体稀释法，将不同浓度的抗菌剂混合在琼脂培养基（或营养肉汤培养基）混凝成平板，然后点种细菌，通过计数不同浓度抗菌剂下细菌的生长数目，确定抗（抑）菌材料抑制实验用菌生长的最低浓度（Guerrero Correa et al.，2020）。该方法适用于不溶性抗（抑）菌材料，且该方法可同时点种多种细菌株。

Wolanov et al.（2013）以E.coli为模型菌，利用琼脂稀释法测定了以ZnO2作为H2O2固态源材料的抗菌性能。将材料的抗菌性能与其H2O2的释放曲线进行对比，发现两者之间具有良好的一致性。

4.3 纳米光催化材料抗菌性能的定量评价——杀菌效果及杀菌效率

杀灭对数值（killing log value，当微生物数量以对数表示时，指消毒前后微生物减少的对数值）和对数杀灭率（在微生物杀灭实验中，用百分率表示微生物数量减少的值）常用于对材料的杀菌效果以及效率进行表示。细胞数量的测定多采用菌落计数法（colony count）。取一定量稀释后的细菌液涂布于凝固后的培养基表面（常用10倍稀释法），在恒定的温度湿度下，培养一定时间，理论上每个活的单细胞均能繁殖成一个菌落，将生长出的菌落数（一般在肉眼可数算范围，以30 — 300 cfu 为最佳）乘以稀释倍数即可推算菌悬浮液中的活菌数，此法即为菌落计数法，菌落浓度以科学计数法a×10ncfu · mL-1表示，也可用对数法表示菌落浓度即lg (a×10n)。

以不加抗菌材料自然生长的菌液作为对照组，浓度为C0，以相同条件下加入抗菌材料的菌液作为材料组，浓度为Cx，通过测定比较（C0-Cx）的数值或（lgC0-lgCx）评价材料的杀菌效果。

抗菌材料抑菌效率的计算公式如下：

式中：R表示抗菌率；Rlg表示对数杀灭率（killing rate）；杀灭对数值= lgC0- lgCx，当杀灭对数值≥2 时，则认为抗菌材料具有杀菌作用。

5 总结及展望

本文从光催化半导体的能带结构与特定ROS的氧化还原电势和影响因素方面综述了·、· OH、H2O2为代表的自由基的产生机制，根据不同半导体的EV、EC和EH的位置关系，可以从热力学上基本确定ROS 的生成及种类，可通过对材料的形貌和尺寸调控、表面贵金属沉积、表面光敏化、半导体复合以及表面等离子体等方式来拓展半导体的光吸收范围和光催化效率，促进ROS 产生。ROS 的检测主要依赖其独有特性，具体包括振动谱学、吸收光谱、发射光谱和电化学技术等。另外，分别从定性和定量的角度介绍了光催化抗菌性能评价方式，重点阐述在分子水平上·、· OH、H2O2三种自由基对细菌等微生物造成氧化损伤和功能失调的具体过程：· O 由于其寿命较长，是光催化纳米材料有效的抗菌活性氧物种，其对细胞膜、蛋白质以及生命遗传物质均具有明显损伤；· OH 具有较强的氧化性能，主要以蛋白质作为初始靶点，使蛋白质发生过氧化，最终造成细胞凋亡；H2O2主要作用于细胞的溶酶体，使其发生脂质过氧化，溶酶体膜发生透化作用，进而导致细胞的凋亡。从以上研究可以看出，光催化反应产生ROS 杀菌过程具有广谱高效、安全稳定、杀菌彻底、绿色环保等优势，其在抑制细菌、病毒等微生物的传播方面具有不可替代的优势。但是，目前光催化抗菌剂的研究和应用主要是针对光催化粉体材料，难以牢固附着、规模应用。因此，开发更多形式的光催化抗菌材料，如可在室温条件下规模应用的光催化“消毒喷剂”等对人们日常生活和聚集的场所进行消杀，势必会进一步拓展光催化在环境消杀领域的应用空间。