组织工程输尿管的研究进展及纺织技术应用前瞻

赵文硕，胡梦博，李超婧，王 璐

(1.东华大学 a.纺织学院,b.纺织行业生物医用纺织材料与技术重点实验室, 上海 201620;2.复旦大学 附属华山医院泌尿外科, 上海 200040)

随着输尿管腔内技术的广泛开展,医源性输尿管损伤发生率逐年增加[1-2],其中包括输尿管镜检查和妇产科手术等导致的输尿管损伤[3-4]。输尿管损伤诊断不及时或处理不当,将会给后续治疗带来巨大困难[5]。长段输尿管损伤是当前的治疗难点,治疗方法包括肠段替代输尿管[6]、自体肾移植[7]、移植物输尿管成型术[8]等。然而,这些手术和移植治疗常会导致狭窄、输尿管瘘、肾积水等术后并发症[9-11],移植治疗还存在供体组织匮乏和供体安全性等问题[12]。因此,使用人工输尿管移植物重建输尿管成为研究热点。

输尿管由内到外分为黏膜层、肌层和外膜三层(见图1)。黏膜层向内折叠,形成一种由多层尿路上皮细胞(urothelial cells, UCs)和固有层(lamina propria, LP)组成的星形内腔,隔绝尿液;肌层主要由平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)构成,分为内侧纵行肌层和外侧环形肌层,具有使输尿管蠕动和防止损伤的功能。因此,在进行输尿管重建时,应保证尿路上皮及时覆盖管腔,同时引导平滑肌组织长入支架。

图1 输尿管层结构示意图Fig.1 Schematic organization of ureter layers

组织工程支架为输尿管组织重建提供了一种可行的方法,其能够模拟天然组织结构和生理微环境,调控细胞生长,促进组织再生。控制材料表面的物理化学性能是组织工程最具挑战性的任务,因为这对细胞的生存和组织原位生长起到重要作用[13]。目前用于制备组织工程输尿管支架的方法主要包括预植入组织诱导再生、模具浇铸、静电纺丝和3D打印等,其中不乏通过对支架结构进行设计从而重建输尿管的尝试。如Versteegden等[14]采用模具浇铸法制备了星形仿生结构以加速输尿管组织重建;Adamowicz等[15]通过静电纺丝技术制备了一种“三明治”结构的材料,以满足输尿管各层对力学与生物性能的需求。但是现有的研究仍无法满足临床需求:一方面,这些研究并没有在微观结构上调节组织工程输尿管支架的表面性能;另一方面,手术操作以及输尿管蠕动导致组织工程支架长期受力,最终影响了UCs和SMCs生长与覆盖的及时性。

纺织技术具有从微纳纤维到贯穿孔织物的跨度,能够精确控制孔径、互联性和力学性能,这赋予了纺织材料在形态、尺度和性能上宽泛的可调控性能,使之能够满足构建组织工程支架的复杂需求。本文回顾国内外研究组织工程输尿管的主要构建策略、材料选择和制备方法,并聚焦基于纺织技术的组织工程输尿管研发现状的相关研究,旨在阐明纺织技术在此领域的应用特点与优势,以期为组织工程输尿管支架的结构优化设计提供新的方向。

1 组织工程输尿管的构建策略

使用组织工程方法进行输尿管重建时,针对组织工程输尿管支架本身,主要有裸支架直接植入体内、支架体外接种细胞后植入体内,以及支架预血管化3种策略。

1)裸支架植入,即直接将组织工程输尿管支架本体植入待重建处。简单快捷,能够满足临床的急切需求,但易发生如纤维化、肾积水等并发症[11,16]。

2)支架体外接种细胞。先将输尿管主要细胞接种在组织工程输尿管支架上于体外培养一定时间,再植入待重建处。提前接种的细胞能够向移植物基体内部生长,并分泌各种生长因子,促进血管生成,改善组织重建效果。为了获得更高的细胞活性和更深层的细胞浸润效果,研究者多选用动态接种方法[17-18]。

3)支架预血管化。在植入待重建处前,将支架植入待输尿管重建动物的网膜或皮下2～4星期,并引导结缔组织在其表面生成。临床上,血管化不良是软组织修复的主要障碍之一[19],这在管状移植物中尤为明显,因为细胞生长受到缺氧和营养供应不足的影响[20-21]。预血管化能够促进新生血管的形成,可提高组织重建效果[22-23],但这种方法难以满足临床的急切需求。

在构建组织工程输尿管时,为了获得良好的重建效果,研究者往往会提前对支架进行体外接种细胞或预血管化等处理,鲜有直接选择裸支架植入的案例;然而临床情况是不可预测和急切的,这尤其与需要漫长准备时间的预血管化相互矛盾。在构建组织工程输尿管时,应尽可能在保证重建效果的条件下,尽快获取组织工程支架,即化解“时间与效果”的矛盾。

2 组织工程输尿管支架的制备

理想的组织工程支架首先应具有良好的生物相容性,以减少植入后免疫排斥和炎性反应。其次,除了应具有能够支持细胞长入的三维结构,以及与组织重塑相匹配的降解速率以外,还应具有良好的力学性能,以便手术操作。此外,考虑到组织工程支架处于尿液环境,尿液不渗透性对组织工程支架而言同样重要。

2.1 组织工程输尿管支架的材料选择

迄今为止,能够用于制备组织工程输尿管支架的材料可细分为天然脱细胞组织材料、天然高分子材料和合成高分子材料3类。

1)天然脱细胞组织材料。主要是从各种组织或器官中获取的脱细胞组织,包括人羊膜[15]和源自不同动物的小肠黏膜下层[24-25]、输尿管[26]、血管[18,27]和膀胱[28]等。脱细胞组织因保留原生组织结构,能够促进组织再生[29-30],但脱细胞过程降低了材料的力学性能,这使其应用受到限制。

2)天然高分子材料。Ⅰ型胶原蛋白是最典型的细胞外基质材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性,可促进尿路上皮细胞的增殖和分化[31]。因此,不少研究采用胶原蛋白构建用于输尿管再生的组织工程支架[32]。但这需要对Ⅰ型胶原蛋白进行交联以增强其力学性能,同时延缓降解[31]。然而,其力学性能仍难以满足组织工程输尿管支架的要求[33]。此外,丝素蛋白因具有良好的力学性能和可塑性,也成为支架材料的选项之一[34]。

3)合成高分子材料。早期人们曾尝试用聚四氟乙烯[35]支架替代输尿管。聚羟基乙酸-乳酸共聚物(PGLA)[32]、聚己内酯(PCL)[36]、聚乳酸(PLA)[37]、聚(L-丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)[15]等生物可降解合成高分子材料因其力学性能良好、可定制、可降解等优点,逐渐被用于组织工程输尿管支架研究。此类材料通常更具疏水性,且缺乏特定的细胞识别信号,不利于细胞和组织的黏附,因此常与生物相容性好的材料联合使用。

2.2 组织工程输尿管支架的制备方法

制备方法决定了组织工程输尿管支架的形态、结构乃至性能。常见的组织工程输尿管支架的制备方法包括预植入组织诱导再生、模具浇铸、静电纺丝和3D生物打印等。

预植入组织诱导再生法通常将裸支架或其他管状物作为模板预先植入动物皮下,待结缔组织生长并覆盖模板后,将其取下作为后续人体移植用支架材料。这种方法的本质是支架预血管化,除了有利于新生血管形成外,还能形成无缝一体化的管状移植物。Liao等[38]将两面分别负载SMCs和SMCs的膀胱脱细胞基质绕导管卷绕后植入网膜,2星期后得到结缔组织包裹的管状组织工程输尿管支架。Zhao等[27]将脂肪源干细胞诱导分化的UCs和SMCs分别接种在脱细胞的血管细胞外基质上,进行组织诱导再生,3星期后将一体化管状输尿管移植物植入兔模型。Liao等[38]和Zhao等[27]都观察到一体化管状输尿管移植物有多层尿路上皮覆盖,且生成了平滑肌组织,但未出现输尿管狭窄或肾积水等症状。预植入组织诱导再生法的有益效果还有待进一步考证[11],再生效果依赖于较长的预植入时间,这与临床中的急切需求相悖。

模具浇铸法是一种将材料溶液或流体浇铸至定制的模具中成型的方法,广泛应用于各种材料制造领域[39-41]。Versteegden等[14]将Ⅰ型胶原浇铸到模具中形成管状,并绕星形芯轴压实、交联,得到具有径向弹性的管状胶原组织工程支架;这种仿输尿管星形内腔的仿生结构,是一种加速组织重建的潜在方法。Janke等[42]将耦合螺旋线圈作为增强骨架,浇铸Ⅰ型胶原后得到的管状结构力学性能近似天然输尿管。虽然使用模具浇铸法能够得到形状尺寸稳定的材料,但制备模具所需的时间和经济成本较大,且无法自由控制尺寸,致使这种方法在组织工程中的应用受到限制。

静电纺丝技术是一种可调控的现代纺织技术,能够直接通过旋转接收辊接收微纳纤维,或将微纳纤维膜绕芯棒卷绕来制备管状材料。所得材料是具有高孔隙率的互联三维结构,能够调控细胞行为和促进组织再生,在生物医用等领域得到广泛应用[43-44]。Kloskowski等[45]分别将静电纺PLCL组织工程支架和脱细胞主动脉弓,以裸支架的形式直接植入大鼠输尿管缺损部位;生物相容性较弱的静电纺PLCL支架表现出并不逊色于脱细胞主动脉弓的重建效果,这是因为PLCL支架较差的浸润性阻碍了尿液的浸润,为细胞和新生组织隔离了有害物质。静电纺丝技术能够自由控制管腔和壁厚,匹配临床上对支架的尺寸需求,还能与3D打印等方法相结合[46-47]。Hu等[48]将3D生物打印与静电纺丝相结合,制备了具有较大孔隙的PCL-丝素蛋白支架。

3D生物打印技术将生物材料和3D打印技术相结合,可构建仿天然组织的材料结构,近年来逐渐在组织工程领域兴起。Takagi等[49]将人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞制成球体,通过3D生物打印层压得到输尿管结构;短期来看,这种材料对于短距离输尿管缺损具有良好的重建效果,但在长段输尿管缺损中的重建效果尚待验证。

3 纺织基组织工程输尿管支架

纺织基材料是由纤维乃至纱线经织造而成的具有贯穿孔的材料,具备诸多结构优点:1)纤维结构能够调节细胞,促进组织再生;2)具有良好的力学性能,在与其他材料复合后具有多层级结构,在能够手术缝合的情况下,可更多地保留力学性能;3)不同的结构层次有利于实现不同的降解行为,从而平衡支架支撑效果与组织长入需求。

3.1 结合生物活性物质的微纳纤维组织工程支架

静电纺丝技术能够在纺丝过程中添加其他成分,以调节和改善材料性能。Shen等[36]将PCL混以两亲性的卵磷脂制成PCL-L静电纺纳米纤维膜,通过将其卷绕、缝合,得到管状化的组织工程支架。Xu等[50]将PLLA混以输尿管ECM或小肠黏膜下层,通过静电纺丝技术制备复合组织特异性支架;结果表明,接种到支架上的UCs相比纯PLLA支架具有更高的细胞活性和数量,表明组织特异性支架可作为促进UCs存活和表型维持的理想基质。

不同于2.2节中所述的结构均一的支架,Shi等[51]将0.8 mm厚、2.0 mm宽的PLA薄膜缠绕在直径为8 F(1 F=1/3 mm)的玻璃棒上后,在其表面纺制一层PLA/胶原静电纺纳米纤维,得到管状PLA/胶原复合组织工程支架。Fu等[17]报道了内径为4 F的同种支架结构,这种外层为混有胶原的纳米纤维、内部为螺旋结构PLLA的复合支架能够负载自体细胞,并起到支持管腔的作用,对输尿管重建而言具有可行性。Adamowicz等[15]设计了一种用于泌尿道重建的“三明治”结构(PLCL-羊膜-PLCL)复合组织工程支架(上下两层为PLCL纳米纤维膜,中间为羊膜)。其中,PLCL纳米纤维膜作为弹性和抗撕裂成分,用于改善力学性能,而羊膜能够促进上皮再生并抑制瘢痕形成,可补足PLCL欠缺的生物活性。这种多层复合结构在调控结构和性能方面具有较高的灵活性。虽然这些工作采用了静电纺丝技术,但没有充分利用其能够精准调控纤维结构的优势。

3.2 可降解编织线增强组织工程支架

在生理环境下,输尿管一直处于移动和承受机械负荷的状态,若组织工程输尿管支架的机械强度不足,可能会出现支架破裂或剥离等问题[52]。因此,支架整体的力学性能不容忽视。De Jonge等[16]以Vicryl编织线(PGLA)制成的管体为骨架,将其置入浇铸胶原蛋白的圆柱形模具,通过插入芯棒(Ø=6 mm)以控制组织工程输尿管支架的管腔直径和管壁厚度;在制备的支架(L=5 cm,Ø=6 mm,Twall=3 mm)中,Vicryl编织线与胶原结合紧密,两端便于缝合,提高了支架本身的机械强度。由于支架本身在植入后缺乏肌肉蠕动,愈合与再生过程中的管体收缩导致尿液滞留与外漏,又因试验选择的猪模型具有组织愈合快速、易纤维化等缺点,不适合用于组织工程输尿管的构建,故De Jonge等[53]增加了支架长度(L=7 cm,Ø=6 mm,Twall=3 mm),并在输尿管重建前1个月将其预植入山羊右侧皮下;预植入后支架血管化良好,虽然平滑肌组织的生长被限制在吻合处,但整体上支架呈现出较为良好的组织再生效果。在De Jonge的研究中,Vicryl编织线作为骨架,为支架提供支撑,使得支架整体的力学性能接近天然组织,并能够承受手术缝合的张力。

3.3 当前研究问题与发展前瞻

将组织工程输尿管支架植入待重建处后,虽然尿路上皮组织再生良好,但平滑肌组织的生长局限于吻合处,无法继续向内生长,这个问题在长段输尿管重建时尤为明显。此外,组织工程输尿管重建一直存在“时间与效果”的矛盾,即选择预植入策略进行输尿管重建时,组织得以更快地生长和愈合,但这类策略往往需要漫长的准备时间,易于导致患者错过最佳治疗时间;若为了及时进行救治而植入裸支架,往往会出现尿瘘、肾积水等并发症。材料种类或移植策略是当前组织工程输尿管支架的热点研究方向,但并不足以解决当前问题。

支架材料能够承载细胞,其化学组成、拓扑结构、刚度等属性均能够调控细胞行为[54]。生物相容性优异的材料往往自身难以具备足够的力学性能,因此在保证细胞潜力的同时,应具备良好的力学性能[55],这样制备出的结构和力学性能可控的支架材料能够对组织工程起到至关重要的作用[56]。因此本文提出通过设计支架材料本身的结构加强其对细胞行为的调控的设想,在现有的针对材料种类和移植策略的研究条件下,降低对支架进行预血管化等处理的必要性,从而在保证及时满足临床需求的前提下提高组织重建效果。

目前纺织材料在组织工程输尿管重建中仅用于结合生物活性物质或作为增强材料,鲜有研究者从组织工程输尿管支架本身力学特征和微纳米尺度拓扑结构等角度出发,对UCs和SMCs等细胞行为的调控作用进行深入研究。由于输尿管支架直径低于1 cm,这增大了组织工程输尿管支架的制备难度。纤维拓扑结构能够调控细胞的黏附、铺展和增殖等行为[57],而纺织技术能够在纤维、纱线和织物3个尺度调控纤维/纱线表面结构(涉及沟槽、多孔、串晶等)和纤维集合体结构(涉及纤维直径和取向、孔径和孔隙率),高度模拟细胞外基质,促进细胞生长和组织再生。静电纺丝技术能够制备拓扑结构可控的静电纺微纳纤维及其纤维集合体,未来应更多地研究静电纺纤维材料的微纳米尺度拓扑结构对细胞行为的调控。编织技术能够通过芯棒直径来决定管腔直径,制备出孔隙均匀、性能可控的小口径管状织物;机织和针织技术,虽然难以直接制备口径足够小的管状结构,但可通过卷绕织物的方式获得管状织物。一方面,通过编织、机织或针织技术制备管状织物作为组织工程支架的骨架,丰富支架层次结构,使支架在被手术缝合和处于复杂体内环境的情况下保持力学性能;另一方面,不同组成和拓扑结构的纱线可作为织造材料,为织物提供微纳米尺度结构的多样性。在设计组织工程输尿管支架时,还应考虑天然输尿管组织的结构,尤其是平滑肌组织内、外侧肌层取向,如何通过结构设计模拟这种天然组织对组织工程输尿管的重建还有待研究。通过结合不同的纺织技术,有望制备出拓扑结构和力学性能多层级、可调控的纺织材料,最终得到便于手术操作,有利于组织再生的组织工程支架,这种组织工程支架在输尿管乃至泌尿系统组织工程领域中具有广阔的应用前景。

4 总结与展望

目前对组织工程输尿管支架材料的种类或移植策略的研究,仍无法兼顾短暂的支架准备时间与良好的组织重建效果,即存在“时间与效果”的矛盾,还存在平滑肌生长受限等问题。

纺织材料具备多层级结构,能精确地调控纤维/纱线表面结构和纤维集合体结构,促进组织重建,但目前纺织材料仅用于结合生物活性物质或作为增强材料,尚未发挥其优势。在开发组织工程输尿管支架时,应结合实际应用环境,并通过设计多层级结构以实现不同功能。例如,以编织、机织或针织等织物作为组织工程支架的骨架,提供规则的贯穿孔结构与宏观力学性能;再通过静电纺丝技术构建的微纳纤维集合体,进一步调整支架微观拓扑结构,以促进组织重建,减少对支架预血管化等后处理的依赖。此外,通过控制微纳纤维的排列方向,还能诱导平滑肌细胞的生长和排列,可解决其生长受限问题。

未来应致力于设计不同材料与纺织技术结合的多层级结构,探究其与输尿管组织细胞行为的关系,并构建宏观上具备优良的力学性能,微观上具备能够调控细胞行为的多层级复合组织工程支架,这将为组织工程输尿管支架乃至其他组织工程支架结构优化设计提供新的方向。