基因多态性对丙戊酸钠及代谢物血药浓度的影响及其与不良反应的相关性研究*

顾澜婷，王雨萍，陆韵竹，许倍铭，陈 冰

上海交通大学医学院附属瑞金医院 药剂科，上海 200025

丙戊酸钠（valproic acid，VPA）是治疗癫痫经典药物，治疗窗较窄，治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）常用于VPA 临床治疗，有效血药浓度范围为50～100 μg·mL-1[1]。多数患者服用VPA较为安全，但仍有不良反应发生，其中肝毒性是最需警惕的不良反应，因此需要定期检查肝功能[2]。研究报道肝功能损伤的不良反应可能与其代谢过程相关，VPA 在体内经过不同代谢途径，形成50 多种代谢物，其中2-丙基-2-戊烯酸（2-propyl-2-pentenoic acid，2-ene-VPA）是VPA 主要的代谢产物，在体内经线粒体β 氧化产生，具有抗癫痫活性，同时也可能导致胰腺炎和高氨血症等不良反应[3]；2-丙基-4-戊烯酸（2-propyl-4-pentenoic acid，4-ene-VPA）可能是与肝毒性相关的主要代谢物之一[4]。同时研究表明[5]，VPA 的部分不良反应发生与遗传因素有密切关系，可能与肝功能损伤相关的基因包括细胞色素 P450 2C9（cytochrome P450 2C9，CYP2C9）、尿苷葡萄糖醛酸转移酶（uridine glucuronate transferase，UGTs）、氨甲酰磷酸合酶1（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）、线粒体聚合酶（mitochondrial polymerase gamma，POLG）、过 氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）等，其中CYP2C9、UGTs 在VPA 代谢中具有重要作用。本文研究基因多态性对中国人群中VPA 及其代谢物血药浓度的影响，并探讨后者与肝功能损伤之间的关系，以期为制定中国人群个体化的VPA 药物治疗方案、避免不良反应发生提供依据。

1 一般资料

纳入2022 年12 月～2023 年5 月于我院诊断为癫痫的患者共99 人，其中男性60 人，女性39 人，年龄（52.72±20.91）岁（7～95 岁），体重（64.36 ±14.73）kg，服用丙戊酸钠片（200 mg ∶100 片/瓶，湖南省湘中制药有限公司）、丙戊酸钠缓释片[0.5 g ∶30片/瓶，赛诺菲（杭州）制药有限公司]或丙戊酸钠口服溶液[12 g ∶300 mL/瓶，赛诺菲（杭州）制药有限公司]，服用剂量为300～1600 mg·d-1,用法用量个体化差异大，部分为800 mg bid、200 mg tid、200 mg bid、400 mg tid、400 mg bid、早200 mg 晚100 mg 等。患者常规进行VPA 浓度监测，共收集常规TDM 和剩余样本144 份，其中检测1 次、2 次、3 次及以上分别为65、25、9 人。

2 主要仪器

3730XL 型DNA 序列检测仪（美国赛默飞ABI公司）；API4000 型三重四级杆质谱仪（美国Applied Biosystems 公司）；UFLC 色谱系统（日本岛津公司）；5804R 台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）。

3 方 法

3.1 标本采集

患者采集血样前，血药浓度已达到稳态（VPA半衰期为7～10 h，经过4～5 个半衰期），于次日早晨服药前静脉采血3 mL，分离上层血清于-20℃保存，用于VPA 及其代谢物血药浓度检测；同时下层血凝块部分用于提取DNA 并基因检测。通过我院信息系统收集监测当日患者肝功能指标。

3.2 VPA 及代谢物血药浓度检测

精密吸取血清样本100 μL 至1.5 mL 离心管中，采用LC-MS/MS 法检测患者VPA 及代谢物2-ene-VPA、4-ene-VPA 血药浓度，检测方法参考文献[6]并作修改，采用Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）分离；流动相A 相为5 mmol·L-1甲酸铵-0.1%甲酸水溶液，B 相为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～0.5 min，20% B；0.5～6 min，20%→85%B；6～6.5 min，85%→95%B；6.5～7 min，95% B；7～9.1 min，95%→20% B；7.1～10 min，20% B；流速0.30 mL·min-1；柱温40℃。采用电喷雾离子化电离源（electron spray ionization，ESI），负离子方式检测，多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）定量。试验回收率、精密度标准偏差均小于15%，稳定性良好。在分析基因多态性对血药浓度的影响时，为消除患者体重与服药剂量对血药浓度的影响，将所得血药浓度除以体重与服药剂量，得到单位体重剂量的校正血药浓度。

3.3 基因检测

从血样中提取DNA，设计不同长度的引物SNaPshot 反应后，检测多个SNP 位点，详见表1。DNA 样本取1 μL 稀释到工作浓度5～10 ng·μL-1，引物稀释到工作浓度50 μmol·L-1。多重PCR 反应：4 μL 扩增引物Premix，10 μL ExTaq（HS），2 μL DNA，4 μL H2O，反应条件为95℃2 min 后，95℃20 s，65°（TD-0.5/C）40 s，72℃1 min，共12 个循环，然后95℃20 s，59℃30 s，72℃1 min，共24 个循环后72℃10 min，在4℃保存。PCR 产物纯化：在15 μL PCR 产物中加入5 U SAP 酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37℃温浴1 h，75℃灭活15 min。SNaPshot 延伸反应：5 μL SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2 μL 纯化后多重PCR 产物，1 μL 延伸引物Premix，2 μL H2O，反应条件为95℃10 s，然后95℃10 s，50℃5 s，60℃30 s，共35 个循环，60℃30 s，在4℃保存。基因型分析采用ABI 3730XL 测序仪基因测序仪完成，利用GeneMapper 4.0（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA）软件分析数据。采用直接测序法检测UGT2B7 rs12233719、UGT1A6 rs2070959 两个位点。

表1 基因多态性位点引物序列

3.4 统计学处理

数据采用SPSS 24.0 软件分析，Hardy-Weinberg 定律检验等位基因型频率是否具有符合遗传规律，计数资料以“%”表示，计量资料以（）表示，采用单因素ANOVA 检验或独立样本t 检验进行比较。相关性研究采用皮尔逊相关分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般资料

99 位患者VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血药浓度详见表2。根据年龄、性别分组均无统计学差异（P ＞0.05）。

表2 99 位患者年龄与VPA 及其代谢血药浓度的值（）

表2 99 位患者年龄与VPA 及其代谢血药浓度的值（）

4.2 基因型及等位基因分布频率

99 位患者UGT2B7（rs12233719、rs7668258）、UGT1A6（rs2070959、rs1105879、rs89910）、CAT rs1001179、CPS1 rs1047891、SOD2 rs4880 基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg 平衡,差异均无统计学意义（P ＞0.05），见表3。3 位患者未检测到rs7668258 位点，3 位患者未检测出rs3087374 位点，可能存在位点缺失；CYP2C9 rs1057910 在检测人群中均为AA 型，无统计学意义，因此未列入后续分析。

表3 99 位患者候选基因的基因型与等位基因分布频率[n（%）]

4.3 药物代谢酶基因多态性与VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 校正血药浓度

99 位患者基因多态性与校正血药浓度的结果详见表4。UGT2B7 rs7668258 TT 型患者2-ene-VPA 校正血药浓度低于CC/CT 型（P ＜0.05）；UGT1A6 rs89910 CT 型患者VPA、2-ene-VPA 校正血药浓度显著高于CC 型患者（P ＜0.05），其余基因型与浓度之间差异无统计学意义（P ＞0.05）。结果表明UGT1A6、UGT2B7 基因多态性可能影响VPA 代谢物浓度。进一步研究发现，根据UGT1A6 rs89910基因型分组，UGT2B7 rs7668258 不同基因型之间差异无统计学意义（P ＞0.05）。

表4 99 位患者候选基因的基因型与等位基因分布频率[n（%）]

4.4 VPA 及代谢物水平、基因多态性对肝功能的影响

本研究未发现肝功能损伤的患者，采集反映肝功能的指标，包括谷氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（as-partate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL），探索其与VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血药浓度的关系。结果（表5）表明VPA 与ALT、AST、ALP 水平相关，而4-ene-VPA 与ALT 相关。进一步研究基因多态性与肝功能指标是否存在相关性，将肝功能指标根据基因多态性进行分组检验，结果显示，CPS1 rs1047891 CC 型ALT、ALP 水平显著低于AA/AC 型患者，CC型与AA/AC 型患者的ALT 分别为（27.86±23.23）和（46.54±51.26）U·L-1（P=0.033）；ALP 分别为（79.41±31.37）和（97.83±47.28）U·L-1（P=0.049）。

表5 VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA 血药浓度与肝功能指标的关系

5 讨论

已有研究发现VPA 的肝功能损伤与其代谢过程及相关酶基因多态性有关。VPA 在体内主要有3条途径代谢：①线粒体的β-氧化途径，主要生成2-ene-VPA 等，约占代谢过程的40%；②细胞色素P450 氧化代谢途径，经CYP2C9 等代谢，主要生成4-ene-VPA；③UGT 是Ⅱ相代谢途径，通过UGT1A6、UGT2B7 等同功酶代谢生成亲水性的葡萄糖醛酸丙戊酸代谢物[7]。VPA 氧化代谢消耗体内抗氧化物质，并能抑制线粒体β-氧化，导致活性氧簇大量积聚，加重肝细胞损伤坏死，可能是VPA 诱导肝毒性的重要原因，而UGT 催化生成Ⅱ相代谢物经肾脏排出体外，可以发挥解毒作用。不同药物代谢酶基因多态性可能影响VPA 及代谢物浓度水平，进而与肝功能损伤等不良反应相关。PharmGKB 数据库 将rs12233719、rs7668258、rs2070959、rs1105879、rs89910、rs3087374、rs1001179、rs4880、rs1057910、rs1047891 基因与VPA 的肝脏毒性联系判定为3级，而相关研究在中国患者中开展较少。

本研究发现，对于患者体内的VPA 及其代谢物血药浓度，性别与年龄并不是其影响因素（P ＞0.05）。UGT 基因型对VPA 及其代谢物浓度具有影响，UGT2B7 rs7668258 CC/CT 组患者2-ene-VPA校正血药浓度显著高于TT 组（P ＜0.05）；UGT1A6 rs89910 CT 型患者VPA、2-ene-VPA 校正血药浓度则均显著高于CC 组患者（P ＜0.05）。前期研究表明[8]，儿童UGT1A6 基因多态性与VPA 的浓度和耐受性方面的临床结果无明显相关性。造成差异性的原因可能是儿童UGTs 表达低于成人，使基因多态性对VPA 的影响被相互作用等情况掩盖[9]。本研究发现UGTs 在VPA 的代谢中发挥了重要作用，在UGTs 活性强的情况下，更多VPA 经Ⅱ相代谢，相应减少氧化途径代谢，在长期应用的情况下，患者VPA 代谢物在体内蓄积减少，可能进一步影响VPA的疗效与不良反应的发生[10，11]。

AST、ALT、ALP、DBIL、TBIL 是临床反映肝脏功能的常规指标。本次研究结果表明，VPA 血药浓度与AST、ALT、ALP 相关，4-ene-VPA 血药浓度与ALT 具有一定相关性，结果与前期报道一致[12]，VPA与代谢物4-ene-VPA 可能是VPA 所致肝功能损伤的原因。本研究未发现肝功能严重损伤患者，大多数患者肝功能指标也在正常范围，可能是研究结果相关系数较低的原因。本次研究也进一步探索了基因多态性与VPA 所致肝功能损伤之间的相关性，结果发现，CPS1 rs1047891 CC 型与AA/AC 型患者相比，两组在ALP、ALT 水平均具有显著差异。CPS1表达于肝脏线粒体内，是催化尿素循环第一步反应，使肝脏发挥解毒功能的关键酶之一，CPS1 rs1047891 CC 型患者解毒能力强，AA/AC 型患者比CC 型患者更容易引起VPA 的肝功能损伤，但是其影响的机制还有待进一步证明。

研究报道CAT rs1001179 在健康组和肝功能异常组中基因多态性也存在显著差异[13]，POLG 在细胞中发挥mtDNA 合成和修复作用，其突变与VPA 诱导的肝毒性有直接关系[14]。本次研究中未证实两者与肝功能指标的相关性。原因可能包括：①这些基因多态性与肝功能相关，但可能并非是VPA引起肝功能改变的特异指标；②本研究纳入的患者中未发生严重肝功能损伤，POLG、CAT 等基因多态性的影响未能充分体现。此外，本研究未将合并用药作为影响因素研究，具有一定局限性，后期需进一步扩大患者样本量，充分考察各方面因素的影响。

本次研究初步探讨了基因多态性对丙戊酸钠及代谢物血药浓度的影响及其与不良反应的联系，发现UGT1A6、UGT2B7 基因多态性与VPA 代谢物2-ene-VPA 水平相关；VPA 及其代谢物4-ene-VPA可能影响肝功能指标，CPS1 rs1047891 基因多态性影响ALT、ALP 水平，VPA 及代谢物浓度及基因多态性可能是肝脏损伤的原因。在进一步研究基础上，建立VPA 及其代谢物与基因多态性与肝功能损伤更加明确的关系，为VPA 患者提供更安全、更科学的个体化治疗方案。