磷对甘蓝型油菜幼苗镉吸收及土壤酶活性的影响

张蓓蓓, 王薪琪, 李卓晴, 吴嘉仪, 吴家萌, 谢华,陈媛, 杜辉辉, 刘孝利, 雷鸣*

(1.湖南农业大学 环境与生态学院,湖南长沙 410128;2.湖南省郴州生态环境监测中心,湖南郴州 424108)

随着工业的快速发展,化肥、农药的滥用使重金属大量积存于农田中,其中镉因影响范围广、污染程度重,成为制约我国农田安全利用的主要重金属污染物[1]。镉通过作物吸收进入食物链,会对人体健康产生极大的危害[2]。因此,作物吸收积累镉的规律是一个值得关注的问题。

油菜是我国大宗的油料作物,具有产油、提供生物质能源、观赏等作用。同时,油菜因生物量大,镉吸附能力强而被认为是修复镉污染土壤的良好选择[3]。研究表明,油菜对镉的富集能力受施加的无机肥的影响[4]。磷是影响作物生长发育的重要养分元素,施磷能为油菜提供充足的养分,促进油菜生长,从而影响油菜对镉的吸收。镉胁迫下施用纳米羟基磷灰石和钙镁磷肥减弱了镉对油菜生长发育的影响,通过提高油菜的株高、根长、叶片数目和生物量,使油菜的镉积累量增加[5]。施加磷肥会通过影响土壤有效镉含量来影响植物吸收积累镉,如施用磷酸氢二铵等,可使土壤pH降低,从而增加有效镉含量[6];施用磷酸氢钙等,可增加土壤对镉的吸附,使有效镉含量降低[7]。土壤酶参与土壤物质的循环过程,对植物生长具有重要意义。崔红标等[8]的研究表明施用羟基磷灰石增加了脲酶活性,降低了酸性磷酸酶活性。Wu等[9]研究表明,在镉污染土壤施用磷酸钙显著增加了土壤的蔗糖酶和脲酶活性,降低了土壤的过氧化氢酶的活性,表明土壤酶活性对磷有显著响应。油菜对镉的吸收积累受多种因素影响[10],研究施磷对有效镉和酶活性的影响对理解油菜吸收积累镉的机制具有重要意义。

本研究结合土壤镉形态、磷形态和土壤酶活性的变化,研究磷添加对油菜吸收积累镉的影响,为镉污染农田的修复与治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以甘蓝型油菜‘油研52’为材料,在湖南农业大学环境与生态学院光照培养室育苗后移栽。育苗环境为:相对湿度70%,温度22℃,光照强度300～320 μmol/(m2·s),光周期为光照14 h/黑暗10 h,所用营养液为改良的霍格兰营养液。

供试土壤为湖南农业大学耘园基地的旱作农田耕作层(0～20 cm)土壤。土壤取回后剔除石子和枯叶等异物,自然风干,过10目尼龙筛,混匀备用。

1.2 试验设置

实验设置了3个镉含量和3个磷含量的交互作用模式,共9个处理,每个处理设置6个平行。使用上口直径10.6 cm,下口直径8.5 cm,高9.5 cm的聚乙烯花盆,每盆装5 kg土样,以CdCl2·5H2O溶液的方式向土壤中加镉,使土壤镉含量达到0.3、3.0和5.0 mg/kg,稳定30天(稳定后测定各处理土壤总镉含量,其值为0.28±0.05、2.82±0.12、4.78±0.25 mg/kg)。稳定后,以KH2PO4溶液形式向土壤中加磷,含量为5.0、75.0、150.0 mg/kg(引入的钾以KCl进行平衡)。氮肥和钾肥以(NH4)2SO4、KCl溶液形式于移栽前一周加入。

油菜长出3～4片真叶、高度约6～10 cm时,选择大小一致的幼苗进行移栽,每盆移栽1株,油菜置于自然环境中生长至抽薹期进行收获。

1.3 样品采集与测定

采用抖土法收集根际土壤,置于阴凉的地方风干。分离油菜和土壤后,于油菜根、茎、叶连接部位剪下,依次使用流动的自来水、超纯水冲洗。洗净的植物样品放入烘箱110 ℃杀青30 min,65 ℃烘至恒重用于后续实验,油菜生物量以干重表示。

1.3.1 油菜各部位镉含量测定

油菜各部位样品镉含量采用硝酸-高氯酸(体积比4∶1)湿法消解,以国家标准物质(GBW—10049)和空白进行质量控制,用电感耦合等离子质谱(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)测定消解液镉含量[10]。

1.3.2 油菜根际羧酸释放量测定

室内和田间实验的数据表明,植物叶片锰含量可以反映根际羧酸盐的释放量[11]。油菜叶片锰含量采用硝酸-高氯酸(体积比4∶1)湿法消解,以国家标准物质(GBW—10049)和空白进行质量控制,用电感耦合等离子质谱(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)测定消解液锰含量[10]。

1.3.3 土壤pH和有效镉含量测定

土壤pH采用pH计(SevenCompactS220,梅特勒-托利多)测定,土水比为1∶2.5(w∶v)[12]。土壤有效镉(DTPA-Cd)采用DTPA提取剂浸提,电感耦合等离子质谱(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)测定提取液镉浓度[10]。

1.3.4 土壤不同磷形态含量测定

采用Deluca等[13]提出的BBP(Biologically-based P extraction approach)法测定生物有效磷(Bioavailable-P)、活性无机磷(Exchangeable-P)、活性有机磷(Hydrolysable-P)和矿物质磷(Ligand-P)。其中,Bioavailable-P用10 mmol/L CaCl2溶液提取;Exchangeable-P用10 mmol/L柠檬酸提取;Hydrolysable-P用磷酸酶和植酸酶的酶混合溶液提取;Ligand-P用1.0 mmol/L HCl溶液提取。最后使用孔雀石绿的方法在630 nm的波长下用酶标仪(TECANSpark 20M)测定提取液的吸光度值,计算各种形态的磷含量。

1.3.5 土壤酶活性测定

采用对硝基苯酚比色法测定β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase,BG)活性。β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1,4-N-acetylglucosaminidase,NAG)活性利用硝基苯酚比色法测定,亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)活性使用对硝基苯胺比色法测定。基于磷酸苯二钠比色法测定酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,采用钼酸铵显色法测定植酸酶(phytase)活性。具体测定步骤均按照苏州科铭生物技术有限公司提供的相应酶活性试剂盒说明书操作,样品使用多功能酶标仪(TECAN-Spark 20M)比色测定。

1.3.6 油菜各部位镉积累量的计算

油菜各部位镉积累量=各部位镉含量×生物量。

1.4 数据处理与分析

数据使用Excel 2019整理,IBM SPSS Statistics 26进行统计分析。本文中所有数据采用平均值±标准偏差(n=6),并用单因素方差分析(ANOVA)和邓肯显著性差异检验,用Origin进行绘图。

2 结果与分析

2.1 磷添加对油菜各部位生物量的影响

镉含量为0.3 mg/kg时,磷添加对油菜生物量的影响不显著。镉含量为3.0 mg/kg和5.0 mg/kg时,油菜植株生物量随着磷添加量的增加而增加,磷添加量由5.0 mg/kg增加至150.0 mg/kg时,油菜植株平均生物量分别由1.59 g增加至2.68 g,由1.61 g增加至2.03 g(图1)。

2.2 磷添加对油菜各部位镉含量的影响

由图2a～c可知,土壤镉含量为0.3、3.0 mg/kg时,油菜各组织镉含量随着磷浓度的增加而呈增加的趋势,土壤镉含量为5.0 mg/kg时,油菜各组织镉含量随着磷浓度的增加而呈减少的趋势。随着磷含量的增加,镉含量为0.3 mg/kg时,油菜根、茎和叶片的平均镉含量分别由0.73、2.53和3.12 mg/kg增加至0.85、2.88和3.62 mg/kg;镉含量为3.0 mg/kg时,油菜根、茎和叶片的平均镉含量分别由13.80、42.20和77.14 mg/kg增加至17.02、57.12和93.69 mg/kg。镉含量为5.0 mg/kg时,与5.0 mg/kg磷添加量相比,75.0 mg/kg和150.0 mg/kg的磷添加分别使根部镉含量降低了9.2%和11.8%,茎部镉含量降低了13.5%和21.2%,叶片镉含量降低了6.2%和8.3%。

2.3 磷添加对油菜各部位镉积累量的影响

由图3可知,磷添加显著增加了油菜根和叶片的镉积累量,而茎镉积累量仅在镉含量为3.0 mg/kg时发生显著变化。土壤镉含量为0.3、3.0、5.0 mg/kg时,油菜植株镉积累量随着磷添加量的增加而呈增加趋势。150.0 mg/kg磷添加时,油菜的镉积累量分别为4.75、164.00、165.62微克/盆。

图2 磷添加对油菜根(a)、茎(b)、叶(c)镉含量的影响Figure 2 Effect of P addition on Cd content of rapeseed root (a), stem (b), and leaf (c)注:不同的小写字母表示在P<0.05的水平上差异显著,下同。

2.4 磷添加对油菜根际pH和有效镉含量的影响

图4a反映了外源磷添加量对不同镉含量土壤pH的影响。在土壤镉含量为0.3、3.0和5.0 mg/kg时,与5.0 mg/kg磷添加相比,150.0 mg/kg磷添加分别使土壤pH降低了0.10、0.11和0.06个单位。

如图4b所示,土壤镉含量为0.3 mg/kg时,磷添加对土壤有效镉含量无显著影响。当土壤镉含量为3.0和5.0 mg/kg时,与5.0 mg/kg的磷添加量相比,75.0 mg/kg的磷添加使土壤有效镉降低了9.5%和11.4%,150.0 mg/kg的磷添加使土壤有效镉含量降低了7.5%和15.2%。

图3 磷添加对油菜根(a)、茎(b)、叶(c)和油菜植株(d)镉积累量的影响Figure 3 Effect of P addition on Cd accumulation of rapeseed root (a), stem (b), leaf (c) and the plant (d)

图4 磷添加对pH(a)和有效镉含量(b)的影响Figure 4 Effect of P addition on pH (a) and DTPA-Cd (b) of soil

2.5 磷添加对油菜根际磷形态的影响

在不同镉和磷处理中土壤磷含量大小的顺序依次为Ligand-P>Exchangeable-P>Hydrolysable-P>Bioavailable-P(图5)。土壤镉含量为0.3 mg/kg时,磷添加量由5.0 mg/kg增加至150.0 mg/kg时,土壤Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P的含量分别由1.08、50.80、1.48 mg/kg增加至1.38、53.51、1.87 mg/kg,Ligand-P的浓度由16 257.00 mg/kg减少至13 503.20 mg/kg;土壤镉含量为3.0 mg/kg时,与5.0 mg/kg磷添加相比,150.0 mg/kg磷添加量使Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量增加了48.7%、4.8%、9.4%,Ligand-P含量减少了10.2%;土壤镉含量为5.0 mg/kg时,与5.0 mg/kg磷添加相比,磷添加量为150.0 mg/kg时土壤的Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量增加了35.9%、5.7%、8.9%,Ligand-P的含量减少了10.3%。

图5 磷添加对土壤生物有效磷(a)、活性无机磷(b)、活性有机磷(c)和矿物质磷(d)的影响Figure 5 Effect of P addition on soil Bioavailable-P (a), Exchangeable-P (b), Hydrolysable-P (c) and Ligand-P (d)

2.6 磷添加对油菜根系释放羧酸的影响

图6表明磷添加降低了油菜叶片Mn含量。土壤镉含量为0.3、3.0、5.0 mg/kg时,与5.0 mg/kg磷添加量相比,75.0 mg/kg外源磷添加时油菜叶片Mn含量分别降低了5.3%、7.2%、10.8%,相比外源磷添加为150.0 mg/kg时分别降低了10.7%、20.2%、10.0%。

2.7 磷添加对油菜根际酶活性的影响

图7为磷添加对油菜根际土壤酶活性的影响。土壤镉含量为0.3 mg/kg时,与外源磷添加量为5.0 mg/kg相比,外源磷添加量为150.0 mg/kg时, NAG和UE的酶活性表现为增加,增幅分别为2.4%、49.12%和20.5%(图7b、图7e);ACP、Phytase和ALP的酶活性表现为降低,降幅分别为11.5%、17.5%、11.8%(图7f～h)。土壤镉含量为3.0 mg/kg时,磷添加量的增加显著提高了NAG、UE的酶活性,显著降低了BG、ACP和ALP的活性。土壤镉含量为5.0 mg/kg时,外源磷的施入,提高了BG(1 626.11～2 038.82 nmol/g·h)、NAG(309.50～420.97 nmol/g·h)、LAP(31.69～33.60 nmol/g·h)、UE(165.05～202.79 nmol/g·h)的活性,但是降低了ACP(1 268.75～1 385.06 nmol/g·h)、ALP(211.45～229.28 nmol/g·h)的活性。

图6 不同镉、磷添加时油菜叶片锰的变化Figure 6 Changes of Mn in leaves of Brassica napuswith different Cd and P addition

图7 不同镉、磷添加时油菜根际酶活性的变化Figure 7 Changes of enzyme activity in rhizosphere of Brassica napus with different Cd and P addition注:a.BG,β-葡萄糖苷酶;b.NAG,β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶;c.LAP,亮氨酸氨基肽酶;d.NAG+LAP,β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶+亮氨酸氨基肽酶;e.UE,脲酶;f.ACP,酸性磷酸酶;g.为Phytase,植酸酶;h.ALP,碱性磷酸酶。

3 讨 论

本研究表明,镉含量为3.0和5.0 mg/kg时,油菜生物量随着磷的增加而增加(图1)。施磷对其他作物也有相同的影响,赵羽楠等[14]的研究表明,在50.0 mg/kg镉胁迫下,磷添加显著增加结缕草叶片的生物量。Carvalho Bertoli等[15]的研究也表明施磷能增加镉胁迫环境下的番茄果实的生物量。生物量是植物生长状况最直接的体现,说明镉含量较高时磷对促进油菜生长有重要的意义[16]。镉含量为0.3 mg/kg和3.0 mg/kg时,油菜各部位镉含量随施磷量的增加而显著增加(图2、图3)。霍洋等[17]和刘文菊等[18]的研究结果表明水稻地上部分镉含量随着磷添加量的增加而增加,认为这是由于在一定的镉含量下,磷添加促进作物根系发育,同时磷添加提高了植物的光合速率,从而促进作物对镉的吸收。但是土壤镉含量为5.0 mg/kg时,油菜各部位镉含量随着施磷量的增加而减少,镉积累量随着施磷量的增加而增加(图2c、图3c),这一现象可能是稀释作用导致的[19],外源磷添加量的增加提高了其生物量,油菜各部位的镉含量表现为降低,油菜的镉积累量表现为增加。

本研究结果表明,磷添加显著降低了土壤pH。本试验添加的磷为KH2PO4,溶解后呈酸性,这可能是土壤pH降低的主要原因[6]。土壤磷形态的变化与土壤理化性质和酶活性有关。在不同镉处理的土壤中,随着磷添加量的增加,Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量表现为增加,Ligand-P含量表现为降低(图5)。Bioavailable-P是土壤溶液中的活性磷库,磷添加量的增加可能使土壤中Bioavailable-P含量增加。Exchangeable-P是指吸附于土壤颗粒表面或与Ca、Fe、Al等形成化合物的磷,当土壤有机酸含量增加时,这种形态的磷可交换释放至土壤溶液中。油菜叶片锰含量与油菜根系羧酸盐释放量呈正相关[11],结果表明,在0.3、3.0、5.0 mg/kg土壤镉含量下,油菜叶片锰含量随着外源磷添加量的增加而减少,这意味着磷添加量低时油菜释放了更多的羧酸盐来促进Exchangeable-P的释放以增加油菜对磷的吸收,导致磷添加量低时土壤的Exchangeable-P含量更低。Hydrolysable-P是指能够被土壤酶活化的有机磷,Hydrolysable-P的矿化依赖于磷酸酶和植酸酶的活性[20]。在0.3、3.0和5.0 mg/kg的镉含量背景下,土壤ACP、ALP酶的活性均随磷添加量的增加而降低,导致Hydrolysable-P释放量降低,进而增加了土壤中可被酶活化的Hydrolysable-P的含量。Ligand-P是难被植物利用的磷,它的含量与土壤pH相关[21],磷添加量的增加降低了土壤pH,这有利于Ligand-P的活化,从而使Ligand-P含量降低。本研究土壤有效镉含量随着磷添加量的增加而降低,而未随土壤pH的降低而增加,可能是因为本试验土壤pH较低,所以pH不是影响土壤有效镉含量的主要因素。土壤有效镉含量降低可能与Ligand-P的释放有关[22]。

酶参与土壤中多种重要的生物化学和物质循环过程,其活性是土壤微生物代谢和养分循环动态变化的敏感指标,可以反映磷添加对镉污染土壤功能的影响[23]。随着磷含量的增加,土壤中ACP和ALP的活性表现为降低(图7f、图7h),NAG和UE的活性表现为增加(图7b、图7e)。有研究表明施磷会降低ACP和ALP的活性[24-25]。Wu等[26]发现施加无机磷肥使土壤UE的活力比空白对照提高了3.2倍。这可能是由于外源添加磷缓解油菜-土壤系统的磷限制,使微生物将更多的资源分配给氮循环相关酶类[27-28]。因此,外源磷可能会通过缓解油菜根际的磷限制促进氮养分循环,改善油菜根际环境。

4 结 论

本研究表明,外源磷虽然降低了土壤pH和土壤有效镉含量,但也促进了土壤矿物质磷的活化,提高了可利用磷库的规模,增加土壤NAG和UE的活性,改善根际养分循环,减弱了镉对油菜生长的影响,从而促进油菜的生长,提高了油菜对镉的积累。本试验仅限在油菜苗期进行,而外源磷添加在油菜整个生育期内对土壤磷镉转化、酶活性变化以及油菜各组织吸收积累镉的影响还有待进一步研究。