去氢木香内酯对肝纤维化模型小鼠的保护作用

方福如, 蔡涛

(湖南环境生物职业技术学院 医学院,湖南 衡阳 421001)

肝纤维化是复杂的病理生理过程。当肝脏受到病毒、酒精、药物等各种损伤性刺激时,肝内结缔组织异常增生,导致细胞外基质过多沉积,破坏肝脏原有的结构和功能。肝纤维化可发展为肝硬化、门静脉高压甚至肝细胞癌[1]。及时的干预和抗纤维化治疗,可使肝纤维化逆转[2],从而可以大大地降低肝硬化、肝癌的发生。

肝纤维化是世界范围内的卫生难题[3],探索肝纤维化的有效治疗方法迫在眉睫,近年来,国内外学者致力于此方面的研究[4],但引发肝纤维化的机制非常复杂,故针对病因的治疗非常困难,根据不同情况定制肝纤维化患者的个性化治疗尤为重要,不同药物联合治疗肝纤维化成为未来肝纤维化治疗的主导趋势。西医的针对病因治疗的方法可以在一定程度上抑制肝纤维化[5]。但是,肝纤维化机制一旦启动,往往呈主动性进展,单一的病因治疗并不能完全抑制炎症,效果局限[6],因此针对纤维组织增生与降解的抗肝纤维化治疗非常必要。

近年来的研究和应用实践已经表明,中医药在治疗肝病尤其是防治肝纤维化领域显示出较大的疗效优势。Huang等[7]通过研究发现阳桃根提取物能改善四氯化碳诱导大鼠的肝纤维化,Liu等[8]研究发现疏肝活血化瘀方通过抑制转化生长因子-β1/Smad信号通路减轻四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化。木香有行气止痛、温中和胃之功效,木香或木香配伍中药临床上可用于治疗消化系统疾病[9]。木香为疏肝和胃颗粒的主药之一,其主要活性成分为去氢木香内酯(Dehydrocostus Lactone,DHL)[10]。去氢木香内酯是倍半萜类化合物,具有抗炎[11]、抗肿瘤[12]以及抗菌[13]等药理活性,已引起人们的关注[14]。有研究表明,去氢木香内酯具有抑制肝癌的作用[15,16]。孙文利等[17]证明,去氢木香内酯可以减轻大鼠肝脏坏死性病理改变,对大鼠肝脏损伤有较好的保护作用。但是去氢木香内酯抗肝纤维化的作用及其相关机制方面尚未见报道。

因此,本研究拟通过探索去氢木香内酯对四氯化碳造模建立的肝纤维化小鼠的抗纤维化保护作用,为肝纤维化的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

40只6～8周龄 C57BL/6J雄性小鼠,SPF级,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 药品与试剂

去氢木香内酯、四氯化碳、橄榄油由麦克林公司提供;天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒购于南京建成生物工程研究所,伊红、苏木素、天狼星红染色试剂盒均来自上海威奥生物科技有限公司;α-SMA抗体、CollagenⅠ抗体来源于美国Proteintech Group公司。

1.3 实验分组及干预

分组:将40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组,分别为对照组、模型组、DHL低剂量组(5 mg/kg)、DHL高剂量组(20 mg/kg),每组10只。造模:腹腔注射溶液,每周2次,持续8周;对照组:腹腔注射橄榄油溶液(5 mL/kg);模型组:腹腔注射20%的CCl4橄榄油溶液,给药体积(5 mL/kg)。干预:于腹腔注射造模第5周进行分组干预,DHL低剂量组灌胃5 mg/kg剂量的药物,DHL高剂量组灌胃20 mg/kg剂量的药物,每天1次,持续4周;对照组、模型组给予等容量的生理盐水。最后一次给药后,禁食24 h,麻醉处死,眼眶取血。

1.4 指标检测

1.4.1 肝脏组织外观及肝体比

观察肝脏外观形态、组织弹性、表面质感等;称量小鼠体重、肝脏体重,根据公式(肝体比=肝重/体重×100%)计算出肝体比并进行比较。

1.4.2 检测血清肝功能

最后一次给药后,禁食24 h,麻醉处死后,采血后静置分离获取血清,采用全自动生化免疫分析仪检测血清中ALT和AST的含量。

1.4.3 肝脏组织病理学观察

取肝右叶同一部位新鲜组织,常规固定、石蜡包埋后,采用苏木精伊红(HE)染色。经烤片、切片脱蜡、苏木素染色、伊红染色、梯度酒精脱水、中性树胶封片后,光学显微镜下观察各组小鼠肝脏组织病理形态变化。

1.4.4 天狼星红胶原染色

取肝右叶同一部位新鲜组织,常规固定、石蜡包埋后,采用天狼星红染色。经烤片、切片脱蜡至水、天狼星红染色液染色、冲洗、吹干、透明、封片,光学显微镜观察各组小鼠肝组织中胶原纤维沉积情况。

1.4.5 免疫组化(IHC)染色检测α-SMA、Collagen Ⅰ在小鼠肝脏的表达情况

取肝右叶同一部位新鲜组织,常规固定、石蜡包埋后,组织切片,经烤片、切片脱蜡、热修复抗原、灭活内源性酶、孵育一抗(α-SMA、CollagenⅠ)、孵育二抗、DAB显色、苏木素复染、各级酒精脱水、中性树胶封片、显微镜观察α-SMA以及CollagenⅠ在各组小鼠肝脏的表达情况。

1.5 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 25.0统计软件对数据进行分析,所有实验数据以均数±标准差表示;多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝脏组织外观

肝脏组织外观(图1)显示,对照组小鼠肝脏组织表面光滑、呈红褐色;模型组小鼠肝脏面不光滑、表面颗粒多、呈灰黄色;与模型组比较,低、高剂量组小鼠肝脏表面欠光滑、有些许颗粒,颜色偏红。

图1 对照组、模型组、DHL低剂量组、DHL高剂量组肝脏形态Figure 1 Liver morphology of control group, model group, DHL low dose group and DHL high dose group

2.2 肝体比与肝功能

与对照组相比,CCl4模型组的肝体比、ALT、AST明显升高(P<0.05),提示CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型造模成功;与模型组比较,DHL低剂量组、HL高剂量组肝体比、ALT、AST明显下降(P<0.05),且高剂量组各指标差异较低剂量组更明显(P<0.05),有剂量依赖性,见表1。

表1 小鼠肝体比与肝功能指标比较Table 1 Comparison of liver body ratio and liver function indexes in mice

2.3 HE染色结果

HE染色结果如图2所示。对照组肝组织中央静脉位于肝小叶的中部,肝细胞核大而圆,连接紧密,以中央静脉为中心,放射状排列,少量炎症细胞浸润;CCl4诱导的模型组肝细胞排列紊乱,肝组织中央静脉周围可见较多纤维组织增生,甚至形成假小叶;DHL低剂量及高剂量组小鼠肝脏组织病理改变均有不同程度的改善。

图2 各组小鼠肝组织HE染色结果(400×)Figure 2 HE staining results of liver tissues of mice in each group(400×)

2.4 天狼星红染色结果

天狼星红染色结果如图3所示。与对照组相比,模型组胶原纤维表达面积显著增加,去氢木香内酯低剂量组、高剂量组小鼠肝脏组织胶原表达有明显改善,高剂量组更为明显。

图3 各组小鼠肝组织天狼星红染色结果(400×)Figure 3 The results of Sirius scarlet staining in the liver tissues of mice in each group(400×)

2.5 IHC检测α-SMA、CollagenⅠ在小鼠肝脏的表达情况

(1)α-SMA抗体染色结果(图4):与对照组相比,模型组小鼠肝组织中α-SMA蛋白表达增加,去氢木香内酯低剂量组、高剂量组肝组织中α-SMA蛋白表达出现了不同程度的下降。

图4 各组小鼠肝组织α-SMA抗体染色结果(400×)Figure 4 Staining results of α-SMA antibody in liver tissues of mice in each group(400×)

(2)CollagenⅠ抗体染色结果(图5):与对照组相比,模型组小鼠肝组织中CollagenⅠ蛋白表达增加,去氢木香内酯低剂量组以及高剂量组肝组织中CollagenⅠ蛋白表达出现不同程度的下降。

图5 各组小鼠肝组织CollagenⅠ抗体染色结果(400×)Figure 5 Staining results of CollagenⅠantibody in liver tissues of mice in each group (400×)

3 讨论与结论

肝纤维化是由各种慢性肝病所致细胞外基质异常沉积的病理过程,早期有效的干预可使肝纤维化逆转,这亦是预防慢性肝病进展为肝硬化、肝癌的关键。病因的治疗可在一定程度上减轻对肝脏的损伤,但是肝纤维化机制一旦启动,往往呈主动性进展,单一的病因治疗不能完全抑制炎症,效果有限,因此,针对纤维组织的增生和降解的抗肝纤维化治疗是非常必要的[6]。

本研究发现,去氢木香内酯能够降低CCl4诱导的小鼠肝纤维化水平,改善其肝功能。去氢木香内酯作为木香的成分之一,可能为肝纤维化的治疗提供一种新的治疗方法。CCl4诱导的小鼠肝纤维化是肝纤维化研究中常用的模型,研究中模型组的肝体比、ALT、AST明显升高,病理可见肝细胞排列紊乱,肝组织中央静脉周围可见较多纤维组织增生,甚至形成假小叶,胶原纤维表达面积显著增加,均提示CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型造模成功。DHL低剂量组、DHL高剂量组肝体比、ALT、AST明显下降(P<0.05),且高剂量组各指标差异较低剂量组更明显(P<0.05);各剂量组小鼠肝脏组织病理变化得到明显的改善,肝组织中α-SMA蛋白、CollagenⅠ蛋白表达出现不同程度的下降;均提示去氢木香内酯能够改善CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝功能和纤维化水平,具有保护作用。

目前,研究表明,肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)的激活是肝纤维化的发生和发展的中心环节,各种损伤因素导致肝星状细胞的增殖和活化[18];活化的肝星状细胞转化为肌成纤维细胞,分泌α-SMA,导致大量ECM的合成增加;产生大量细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM),而CollagenⅠ是HSCs活化后释放的最主要的细胞外基质[19]。本研究通过免疫组化染色探究了DHL对小鼠肝组织中CollagenⅠ、α-SMA的影响,结果显示,模型组小鼠肝组织中CollagenⅠ、α-SMA蛋白的表达水平均较对照组显著升高,提示小鼠肝纤维化模型建模成功。

传统治疗肝纤维化的研究中表明,TGF-β1是促进肝纤维化的关键细胞因子,可通过多种途径刺激肝星状细胞活化,促进肝纤维化[20],同时,TGF-β1的释放会进一步促进炎症的发展、抑制免疫反应;Smad蛋白是TGF-β信号转导的关键下游信号分子,TGF-β通过提高Smad2/3的磷酸化水平促进肝纤维化[21]。去氢木香内酯对肝星状细胞的增殖、凋亡和细胞周期是否有影响,其中的内在分子机制如何,是否通过调控TGF-β1/Smad2/Smad3信号通路防治肝纤维化的发生发展,是我们深入探索的方向,有待进一步研究。

综上所述,去氢木香内酯对四氯化碳造模建立的肝纤维化小鼠具有抗纤维化作用。本研究从肝脏生化、病理、免疫组化的层面进一步证明去氢木香内酯对肝纤维化的改善作用,为肝纤维化的临床治疗提供实验依据,为肝纤维化的研究提供理论依据。