基于数据挖掘的骨肉瘤动物模型应用分析

喻帅克罗茂丽王连睿周天豹苗明三白 莉

(河南中医药大学,郑州 450046)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是骨组织常见的原发性恶性肿瘤,全球发病率每一百万人约有4 人,好发于15 ～19 岁的青少年[1-3],主要表现为疼痛、肿块、跛行等,具有高转移性、预后差、病情发展迅速等特点[4-6]。 OS 现代治疗多采用放疗、化疗、根治性手术切除和晚期截肢[7-8],多方法结合治疗虽然可以抑制癌细胞增殖和减少转移风险,却为机体带来不可逆损伤和残疾,化疗毒性和耐药性导致机体免疫下降,加深了患者的痛苦[9-12]。 因此,对OS 的发病机制,以及有效的治疗方法和药物进行更深入的研究是非常有必要的,而稳定可靠的动物模型是开展OS 相关研究的关键和基础。 OS 动物模型应用于骨肉瘤相关研究已有较长的历史,创造了多种可行的造模方式,例如病毒诱导模型[13]、辐射诱导模型[14]、肿瘤移植模型[15]等,但相关文献缺少统一的模型制备及评价标准。 本文将通过对骨肉瘤动物模型研究的文献进行归纳分析,探讨模型动物的选择、造模方法、主要检测指标等,以期为骨肉瘤动物模型的完善提供方法学参考。

1 材料和方法

1.1 资料来源

在中国知网(CNKI)、万方数据库知识服务平台(Wanfang)中以“骨肉瘤”“动物”为主题词进行检索,锁定检索年限2000 年1 月～2022 年10 月,在PubMed 数 据 库 以“(osteosarcoma) AND (animal model)”进行检索,检索时间范围均设置为2019 年10 月～2022 年10 月。 其中中国知网数据库检索出相关期刊文献1478 篇、万方数据库799 篇、PubMed数据库检索文献227 篇,文献总数为2504 篇。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准:选择具有骨肉瘤动物模型应用的实验性期刊文献,排除标准:(1)会议性文献、硕博士学位论文、综述类文献、理论研究类文献;(2)未明确记录造模方法或实验动物种类的文献;(3)数据库之间重复的文献。

1.3 数据规范

实验动物名称、种类等均参照《实验动物和动物实验技术》[16]进行规范总结。

1.4 数据处理及分析

将纳入标准的284 篇文献的实验动物种类、性别、造模方法、癌细胞种类、检测指标等数据录入Excel 表,建立骨肉瘤动物模型数据库。 使用Microsoft Excel 2016 进行统计学处理与分析。

2 结果

2.1 文献筛选结果

初次检索到文献2504 篇,排除不符合标准以及重复的文献,最终筛选得到符合标准的文献284 篇,建立数据库。 分析数据库发现OS 动物模型使用频数为302 例,一篇文献中出现两次及以上OS 模型的原因是比较不同造模方法[17],以及癌细胞株种类原因[18-19]引起的药效差异和模型成功率差异。

2.2 骨肉瘤造模动物种类

将284 篇文献中使用的动物种类进行统计,共有实验动物15 类[20-26]。 其中使用频次＞10 的共有3 种,使用最多的为BALB/c-nu/nu 裸鼠(227 例,75.17%),其次为SD 大鼠(20 例,6.62%)和C3H小鼠(11 例,3.64%)。 动物年龄多为(4 ～6)周龄、(6～8)周龄,实验动物性别选择以雌性为主,共101例,占比35.94%,其次为雄性(99 例,35.23%),雌雄各半(81 例,28.83%)(21 篇文献未注明性别情况,故不计入统计),动物种类分布情况见表1。

表1 骨肉瘤模型动物种类Table 1 Osteosarcoma model animal species

2.3 骨肉瘤动物模型造模方法

统计纳入标准的284 篇文献中骨肉瘤动物模型的造模方法,发现异位移植法使用频数为230 例,原位移植法为72 例,且异位移植模型以细胞液移植为主。 异位移植法中背部皮下移植(66 例,21.85%)最多,其次为腋部皮下移植(55 例,18.21%)、后肢皮下移植(41 例,13.58%);原位移植法是接种在股骨远端或胫骨近端的骨髓腔,其中细胞液移植(51例,16.89%)、组织块移植(21 例,6.95%)。 细胞液移植法中明确表明细胞数量的有242 例,多选择1×107/mL 或1×106/mL 癌细胞浓度注射;瘤组织块移植法中瘤组织直径以1～2 mm 大小为主。 详细造模情况见表2、表3。

表2 骨肉瘤动物模型造模方法Table 2 Methods for the animal model of osteosarcoma

表3 细胞液移植法癌细胞浓度Table 3 Cancer cell concentrations by cell fluid transplantation

2.4 骨肉瘤动物模型造模癌细胞株种类

在纳入的284 篇文献中,癌细胞种类使用频次＞15 的有5 种,分别是人源骨肉瘤MG-63 细胞100例,鼠源骨肉瘤UMR-106 细胞39 例、人源骨肉瘤143B 细胞31 例、患者肿瘤细胞混悬液23 例、人源骨肉瘤U2OS 细胞17 例。 详细分布见表4。

表4 骨肉瘤动物模型造模癌细胞株种类Table 4 Type of molded cancer cell lines in animal models of osteosarcoma

2.5 骨肉瘤动物模型检测指标

统计纳入标准的284 篇文献中骨肉瘤动物模型的检测指标,若检测指标为同一组织的多个同类型指标,则归为一类,不再分开统计[27],如血清中同时检测TNF-α、IL-6、VEGF、IL-2 水平等;若同一组织被分成不同种类的检测指标,则分别统计,如肿瘤组织在同一动物实验中既检测肿瘤组织免疫组化又检测肿瘤组织病理。 且因同一文献中,不同造模方法的检测指标相同,故检测指标百分比通过纳入文献数量计算。 其中频数＞50 的有5 项,检测最多的为肿瘤组织表观指标:肿瘤大小、瘤径、个数、重量等(238 例,83.80%);肿瘤组织HE 病理染色(129 例,45.42%);动物表观指标:体重、毛发、饮食、活动状态等(94 例,33.10%);肿瘤组织免疫组化: VEGF、 Bax、 Bcl-2、 Caspase-3、 NF-κB、 CD34、CD31、HIF-1α、Ki67 等(89 例,31.34%);抑瘤率(71例,25.00%)。 骨肉瘤动物模型检测指标详情见表5。

表5 骨肉瘤动物模型检测指标Table 5 Test indexes of the animal model of osteosarcoma

3 讨论

骨肉瘤有两个高发期,一个是儿童及青少年时期,多原发性发于长骨的干骺端, 以股骨远端及胫骨近端最为常见[28-29],可能与骨的生长活动有关[30],另一个是骨肉瘤高发期是老年期,患者中多为继发性肿瘤,常与Pagets 骨病(Paget disease of bone)及放疗后恶变等相关[31-33]。 患者临床表现多为局部疼痛与肿胀,且夜间病发较为严重[34]。 但现有OS 模型尚不完全符合OS 临床病症特点,因此进一步研究OS 模型,对OS 发病机制,以及新药研发具有重要意义。 下面对数据库进行分析,以期为建立简便稳定的骨肉瘤模型提供参考。

3.1 常用实验动物分析

本文通过OS 动物模型实验性文献分析发现,骨肉瘤动物模型以鼠类为主要来源,小鼠以BALB/c-nu/nu 裸鼠为主,大鼠以SD 大鼠为主。 鼠类在遗传学、病理学、生物学等方面与人类非常相似,且鼠类生长周期短,时间成本低,价格低廉,是做动物实验的理想材料[35]。 首选模型动物BALB/c-nu/nu裸鼠缺乏成熟的胸腺和免疫T 细胞,细胞免疫功能低下,对同种或异种移植物排斥力低。 又因裸鼠无毛,便于观察和测量肿瘤的生长情况,故BALB/cnu/nu 裸鼠更适用于制备骨肉瘤模型[36]。 纵观BALB/c-nu/nu 裸鼠生理周期,4 周龄以下裸鼠可能不耐受,导致裸鼠死亡,而6 周龄以上裸鼠体内NK细胞活性增加,免疫力会呈现一定程度的增强[37-38],导致成瘤率降低,因此选择4 ～6 周龄裸鼠有利于肿瘤的生长与转移[39]。

3.2 常用造模方法及肿瘤细胞分析

建立与临床吻合度高的OS 动物模型是其机制研究与新药研发的重要基础。 数据分析发现目前OS 模型造模方法主要以异位移植造模为主,占比76.16%,其中背部皮下移植最多,其次为腋部皮下移植、后肢皮下移植。 目前常用的骨肉瘤造模方法各有优劣:(1)皮下异位移植模型操作简便,肿瘤表浅,便于观察肿瘤的生长,记录肿瘤的生长曲线,但这种造模方法与原发性骨肉瘤中的转移、复发有较大差别[40];(2)尾静脉细胞液移植法是考察骨肉瘤肺转移的重要手段,易于成模;(3)原位移植满足了肿瘤生长所需要的局部微环境,具有良好的重复性,但原位移植需要手术操作,暴露股骨或胫骨[39,41],需考虑手术后预防感染的问题;(4)细胞液移植法增大了肿瘤细胞与周围组织的接触面积,肿瘤新生血管可为其提供更好的血供,但在细胞液中肿瘤细胞处于游离状态,可能会沿针道走行,致使细胞液流出或错位移植等问题[23];(5)组织块移植法易于固定[42],但瘤组织块有限的接触面积限制了机体对整个瘤组织的血供,影响了肿瘤传代率,且创面手术增加了术后出血和感染的风险[43]。

接种的肿瘤细胞种类是影响骨肉瘤动物模型的重要因素之一,经统计,使用较多的骨肉瘤细胞为人源MG-63 细胞和鼠源UMR-106 细胞,两者均具有较高的成模率。 其中人源MG-63 细胞具有较高的肺转移率[44-45],且人源MG-63 细胞能更好地反映骨肉瘤患者的临床特征,以便实验结果的临床转化。 同时为保证细胞活力,可在荷瘤前1 d 更换培养基,提高接种成功率[23]。

3.3 高频检测指标分析

根据统计发现,研究者主要通过表观指标、抑瘤率、肿瘤组织病理、肿瘤组织免疫组化、肿瘤组织PCR、血清中细胞因子表达等指标检测,评价骨肉瘤模型成模情况和药物疗效。 所统计文献中,表观指标包括肿瘤组织表观指标(肿瘤瘤径、个数、重量)和动物表观指标(如体重、毛发、饮食、活动状态等),可初步判定骨肉瘤模型成模情况。 肿瘤组织病理进一步判断骨肉瘤模型的病变程度和药物疗效。 肿瘤组织免疫组化、PCR、Western blot 等分子生物学检测主要围绕着细胞凋亡、炎症因子、细胞增殖、细胞侵袭、肿瘤血管生成等展开,故多选择与之 相 关 的Bcl-2、 Bax、 Caspase-3、 NF-κB、 STAT3、MEPK、VEGF 等相关通路进行研究[26,46-48],同时肿瘤组织和血清的生化指标与病理染色相互佐证,进一步探究OS 的机制通路。

综上所述,目前对骨肉瘤研究多选择4 ～6 周龄的BALB/c-nu/nu 裸鼠,性别不限,多使用细胞液移植法异位造模,癌细胞主要选择MG-63 细胞、UMR-106 细胞、143B 细胞或U2OS 细胞,检测指标多选择肿瘤组织表观指标、肿瘤组织HE 染色、肿瘤组织免疫组化、动物表观指标、抑瘤率等。 同时,在分析过程中发现了一些问题:(1)所统计文献中阳性药涉及较少;(2)大多文献未提及动物成模的标准,且模型成功的判定没有统一的标准。 综合动物伦理学与实验实际需要,建议小鼠成模标准为小鼠肿瘤体积在100～150 mm3;(3)血清生化指标LDH 和ALP是临床检测中的重要依据[49],建议未来的动物模型中将其作为重要指标进行考察;(4)中医认为骨肉瘤病因病机为气虚、血瘀、痰浊,而目前骨肉瘤动物模型少有对应的中医指征,因此可在造模时加入中医致病因素,如高脂饲料喂养等方法,诱发模型动物痰浊血瘀,配合肿瘤细胞液皮下移植,构建符合中西医临床病证结合要求的骨肉瘤动物模型。

本文通过对骨肉瘤动物模型相关文献挖掘与分析,对常用骨肉瘤动物模型的动物选择、造模方法、优缺点及检测指标进行整理比较,并针对不足之处进行探讨,希望本文可为后续模型完善提供思路,为建立更符合发病机制的动物模型提供参考。