lncRNA SNHG16 通过调控miR-570 对肝癌细胞索拉非尼耐药的机制研究

柳 扬范 伟*丁 洁

(1.贵州省人民医院肝胆外科二部,贵阳 550002;2.贵州省人民医院肿瘤科,贵阳 550002)

原发性肝癌的死亡率在全世界排名第三,患病率位居第五,有约70%的肝癌患者在确诊时已处于晚期,生存时长低于1 年[1-2]。 索拉非尼属于在肝癌治疗指南中主要推荐的诊治晚期肝癌的重要方案,有效率约40%,但其长时间服用会出现耐药性,最后导致治疗效果相对较差[3-4]。 且有越来越多的学者研究显示,肿瘤中的上皮-间质的转化为影响药物耐药的因素之一,但耐药机制尚不清晰,因而探究索拉非尼的耐药机制对于晚期肝细胞肝癌临床效果的改善及预后有着积极作用。 lncRNA 为一类特异性的非编码RNA,在修饰组蛋白、重塑基因构造、转录及遗传后基因的表达等过程中起到了一定的作用,SNHG16 属于lncRNA 家族中的其中一员,且在miRNA 分子的作用下能够对细胞的分化及增殖有效调节,并在肿瘤的化疗耐药及发展中有所参与[5]。 miR-570 是肿瘤抑制因子的一种,在减缓肝癌细胞增殖、血管的生长中有着重要的作用,且在血清及肝癌组织内其表达呈低水平[6]。 基于此,本文探究了lncRNA SNHG16 通过靶向调控miR-570 可有效改善肝癌细胞HepG2 对于索拉非尼的耐药性,效果显著。

1 材料和方法

1.1 细胞

人肝癌细胞HepG2 购自于(澳睿赛生物技术(上海)有限公司;货号:ORC0088)。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI-1640 培养基(上海百赛生物技术股份有限公司,货号:10-040-CM);MTT 试剂(艾美捷科技有限公司,货号:MBS843090-C);Lipofectamine TM 2000 转染试剂(11668019)购自于北京百奥创新科技有限公司;BCA 蛋白试剂盒(赛默飞世尔科技,货号:23221-23230);CyclinD1、P21、MMP9、MMP2 抗体分别购自于上海抚生实业有限公司、北京泽平科技有限责任公司、北京义翘神州科技股份有限公司。 酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司,型号:SpectraMax iD5);流式细胞仪(上海顶仪科技有限公司,型号:FACSCalibur)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

通过浓度递增方法对肝癌细胞HepG2 实施长期的培养,创建索拉非尼耐药HepG2 细胞株模型,即为HepG2-R。 使用HepG2 作亲本细胞,通过在37℃、5% CO2的环境中培育,待细胞的状态平稳后,在培养液中置入1、2、4、8 及16 μmol/L 索拉非尼,行1 周培育后,索拉非尼换为更高的含量,直到在索拉非尼(16 μmol/L)的培养液中细胞能稳定生长,说明诱导HepG2-R 细胞成功。 后续在培养基中对HepG2-R 细胞中低浓度的索拉非尼施以常规培育,维持耐药性,且将HepG2 的正常细胞标记成HepG2-P。

1.3.2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌细胞中表达水平检测

提取肝癌细胞、正常肝细胞中总RNA,逆转录为cDNA,选取实时荧光定量法予以检测lncRNA SNHG16、miR-570 表达量,采用Primer 5.0 软件设计引物序列,PCR 反应体系:0.5 μL 的上下游引物、模板为2 μL cDNA、8 μL 的SYBR Green,放蒸馏水至30 μL。 反应条件:96℃ 6 min、92℃ 30 s、75℃45 s,80℃ 10 min,共行45 个循环,以GAPDH 为内参,采取2-△△Ct方法计算出lncRNA SNHG16、miR-570 的表达量。 (见表1)

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.3 细胞转染

通过对SNHG16 的siRNA 进行合成,HepG2-R细胞按密度为2×105/孔置于6 个孔板内,待细胞开始贴壁后,放入含10%胎牛血清的RPMI-1640。 培养箱内培育24 h,细胞融合程度为35%～55%,后将完成稀释的HepG2 siRNA 混合于LipofectamineTM2000 试剂中,产生HepG2 siRNA/LipofectamineTM2000 复合物,接着在细胞培养板孔中加HepG2 siRNA 转染载体予以融合,后置入5% CO237℃的培养箱实施培育,6 h 之后换为RPMI-1640 培养液(含10% 胎牛血清),20 h 恢复生长,使用荧光显微镜检测细胞荧光蛋白的表达量,使用qRT-PCR 法检测转染率,确认成功转染后,分别将其记作HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 组、HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 组、HepG2-R+anti-miR-570 组、HepG2-R + anti-miR-NC 组、 HepG2-R + pcDNA SNHG16 组和HepG2-R+pcDNA 组,用于后续的试验。 接着将si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-570 通过类似的操作在HepG2 细胞内实施转染,分别记si-NC 组、si-SNHG16 组、miRNC 组和miR-570 组。

1.3.4 MTT 法测定细胞增殖抑制率

集取细胞,调至5×105/mL,于96 孔板内进行接种,加MTT 溶液(5 g/L 25 μL),培育4 h,去除清液,放入二甲基亚砜(DMSO)(120 μL),摇匀,直到结晶紫开始融化,后将酶标仪调到470 nm 波长,以此对细胞吸光(A)值进行测定。 细胞增殖抑制率=(对照组A 值-试验组A 值)/对照组A 值×100%。并根据药物的浓度及抑制率分别记作横轴与纵轴,描绘出浓度对应的曲线,算出半数的抑制浓度IC50。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞的凋亡

按照上述的形式收集每组的HepG2-R 细胞通过PBS 洗涤后制出单细胞的悬浮液(2×105/mL),接着将100 mL 细胞悬浮液放入96 孔板中,后滴加Annexin V-FITC 6 mL,在5℃环境中培育约30 min,接着加4 mL 的碘化丙啶,均匀混合后于室温下培育10 min,并采用流式细胞仪测试细胞的凋亡。

1.3.6 Transwell 测定细胞迁移

首先将细胞在无血清的培养基中培育24 h,集取细胞,调节至5×106/mL,取150 μL 的细胞放于Transwell 小室的上室中,取550 μL 含有清液的培养基放于Transwell 小室的下室中,后将Transwell 小室放置于培养箱内培育48 h,接着预备结晶紫染色液与甲醛固定液予以备用,后将Transwell 小室取出,利用棉签缓慢地擦拭掉聚碳酸酯膜表面上的细胞,后将膜移置固定液内,30 ～35 min,接着将膜放入染色液内15 min 进行染色,后通过镊子缓慢将膜的下方朝上置于载玻片予以固定,使用光镜检测细胞数目,取其平均数值。

1.3.7 CyclinD1、P21、MMP9、MMP2 检测

选用Western blot 法测定细胞内的细胞周期蛋白(CyclinD1、P21、MMP9、MMP2)表达,首先在含甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液内使细胞发生裂解反应,取蛋白后经BCA 法对蛋白进行定量测定,接着在沸水内进行约15 min 的浸泡处理,使其变性,加样本,调节60 V 电压实施电泳处理,40 min 左右,调电压到120 V 后继续电泳,90 ～120 min 后停止,将蛋白经转膜仪换至PVDF 膜上,在低温环境下转膜,完成后通过5%的脱脂奶粉进行1 h 封闭处理,培养一抗(抗体P21、CyclinD1、MMP2、MMP9)、二抗(经过氧化酶所标记后的LgG 抗体),并在暗室放置膜,加ECL 试剂,用凝胶检测软件观察条带的灰度数值,内参为GAPDH。

1.3.8 双荧光素酶报告试验

集取细胞,取裂解液裂解细胞,加荧光素酶底物(5 μL)、缓冲液,混匀,测定荧光强度,放入缓冲液及底物,混匀,对荧光的强度进行检测。 实验重复5 次,分别对各个样本作复孔3 个,最后对荧光素酶强度比较分析,检测SNHG16 联合miR-570 在细胞中的影响。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0 软件分析,shapiro-wilk 检验符合正态分布,以平均数±标准差(±s)表示,采用重读测量方差分析,同一时间点两组间比较采用独立样本t检验,多组间进行比较采用F检验,以率(%)表示计数资料采用x2检验,P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌细胞组织及正常肝组织中的表达

如表2 所示,与人体正常肝组织相比,肝癌细胞组织的lncRNA SNHG16 表达升高,miR-570 表达下降,具有显著性差异(P＜0.05)。

表2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌细胞组织组及正常肝组织组中的表达(±s)Table 2 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cell tissue group and normal liver tissue group

表2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌细胞组织组及正常肝组织组中的表达(±s)Table 2 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cell tissue group and normal liver tissue group

注:与人体正常肝组织组相比, aP＜0.05。Note.Compared with human normal liver tissue group, aP＜0.05.

组别Groups宿主基因16 SNHG16 miR-570人体正常肝组织组Human normal liver tissue group 1.13±0.14 1.08±0.20肝癌细胞组织组Liver cancer cell tissue group 2.10±0.27a 0.61±0.15a t 12.350 7.281 P＜0.001 ＜0.001

2.2 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌细胞及肝癌不同浓度的索拉非尼耐药细胞中的表达

如表3 所示,与HepG2-P 组相比,HepG2-R 组LncRNA SNHG16 表达上升,miR-570 表达水平下降(P＜0.05),表明与HepG2-P 组对比,HepG2-R 组细胞在索拉非尼浓度为1、2、4、8、16 μmol/L 中的抑制率均下降,IC50值上升,具有显著性差异(P＜0.05)。

表3 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌细胞及肝癌不同浓度的索拉非尼耐药细胞中的表达(±s)Table 3 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cells and Sorafenib resistant cells with different concentrations of liver cancer

表3 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌细胞及肝癌不同浓度的索拉非尼耐药细胞中的表达(±s)Table 3 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cells and Sorafenib resistant cells with different concentrations of liver cancer

注:与HepG2-P 组相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-P group, aP＜0.05.

组别Groups宿主基因16 SNHG16 miR-570 半抑制浓度(μmol/L)IC50索拉非尼(μmol/L)Sorafenib 1 2 4 8 16 HepG2-P 组HepG2-P group 1.12±0.16 1.05±0.1 8 30.28±2.11 6.97±0.71 20.95±2.77 38.86±3.18 69.34±6.06 86.24±9.05 HepG2-R 组HepG2-R group 2.08±0.22a 0.59±0.10a 200.46±12.07a 5.06±0.57a 16.57±2.03a 24.43±2.26a 37.41±2.58a 40.57±5.69a t 13.670 8.652 53.790 8.125 4.940 14.330 18.780 16.550 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 lncRNA SNHG16 过表达联合索拉非尼对HepG2-R 细胞增殖、凋亡、迁移的影响

如表4,图1、图2 所示,HepG2-R+pcDNA SNHG16 作为过表达组,其lncRNA SNHG16 表达明显升高(P＜0.05),表明lncRNA SNHG16 过表达的HepG2-R 细胞株构建成功,与HepG2-R+pcDNA 组相比,HepG2-R+pcDNA SNHG16 组的迁移细胞个数及CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2 的表达水平降低,抑制率、凋亡率及P21 的表达水平上升,具有显著性差异(P＜0.05)。

图1 增殖、凋亡、迁移相关蛋白表达Figure 1 Expression of proteins related to proliferation,apoptosis and migration

图2 细胞凋亡图Figure 2 Cell apoptosis

表4 lncRNA SNHG16 过表达联合索拉非尼对HepG2-R 细胞增殖、凋亡、迁移的影响(±s)Table 4 Effects of lncRNA SNHG16 overexpression combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

表4 lncRNA SNHG16 过表达联合索拉非尼对HepG2-R 细胞增殖、凋亡、迁移的影响(±s)Table 4 Effects of lncRNA SNHG16 overexpression combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

注:与HepG2-R+pcDNA 组相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+pcDNA group, aP＜0.05.

组别Groups HepG2-R+pcDNA 组HepG2-R+pcDNA group H H ep e Gp G 2-2 R-R+p+cp Dc D NN AA S N SN H H GG 1 6 1 6 g r组oup t P宿S主N基H G因16 1 6 1.17±0.15 2.12±0.24a 13.000 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 11.72±1.10 42.29±2.44a 44.240 ＜0.001 A凋po亡pt率osi(s%ra)te 17.87±2.09 22.41±3.24a 4.560 ＜0.001迁移的细胞个数(n)Number of migrated cells 138.51±10.16 83.28±7.55a 16.900 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.95±0.13 0.51±0.07a 11.540 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗体0.35±0.09 0.73±0.14a 8.843 ＜0.001基质金M属MP蛋-9白酶90.67±0.08 0.35±0.05a 13.140 ＜0.001基质金M属MP蛋-2白酶20.83±0.09 0.49±0.06a 12.170 ＜0.001

2.4 抑制miR-570 表达联合索拉非尼对HepG2-R细胞增殖、凋亡、迁移的影响

如表5,图3、图4 所示,与HepG2-R+anti-miRNC 组相比,HepG2-R+anti-miR-570 组miR-570 表达水平降低(P＜0.05),表明抑制miR-570 的HepG2-R细胞株构建成功,与HepG2-R+anti-miR-NC 组比较,HepG2-R+anti-miR-570 组CyclinD1、MMP-9、MMP-2表达水平降低,抑制率、凋亡率及P21 表达水平升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图3 增殖、凋亡、迁移相关蛋白表达Figure 3 Expression of proteins related to proliferation,apoptosis and migration

图4 细胞凋亡图Figure 4 Cell apoptosis

表5 抑制miR-570 表达联合索拉非尼对HepG2-R 细胞增殖、凋亡、迁移的影响(±s)Table 5 Effects of miR-570 inhibition combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

表5 抑制miR-570 表达联合索拉非尼对HepG2-R 细胞增殖、凋亡、迁移的影响(±s)Table 5 Effects of miR-570 inhibition combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

注:与HepG2-R+anti-miR-NC 组相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+anti-miR-NC group, aP＜0.05.

组别Groups HepG2-R+anti-miR-NC 组HepG2-R+anti-miR-NC group H H ep e Gp G 2-2 R-R+a+na tn i-t mi-m iR iR-5-75 07 0 g r组oup t P微小mi R R N-5 A 7-05 701.11±0.12 0.52±0.09a 15.230 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 12.36±2.25 41.61±3.18a 29.080 ＜0.001 A凋po亡pt率osi(s%ra)te 18.32±2.11 24.46±3.47a 5.856 ＜0.001 N迁um移be的r o细f m胞ig个ra数ted(c n e)lls 76.86±8.10 40.43±6.06a 13.950 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.76±0.09 0.39±0.06a 13.250 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗体0.33±0.04 0.79±0.09a 18.090 ＜0.001基质金M属MP蛋-9白酶90.68±0.07 0.25±0.04a 20.660 ＜0.001基质金M属MP蛋-2白酶20.79±0.08 0.36±0.05a 17.650 ＜0.001

2.5 双荧光素酶报告试验

如表6 所示,双荧光素酶报告试验显示,miRNC 组WT-SNHG16、miR-570 组WT-SNHG16、miRNC 组MUT-SNHG16、miR-570 组MUT-SNHG16 细胞相对荧光素酶表达活性分别为(1.16±0.14)、(0.50±0.10)、(1.02±0.08)、(0.98±0.07),且相较于miR-NC 组WT-SNHG16,miR-570 组WT-SNHG16 表达活性较低,说明lncRNA SNHG16 靶向调控miR-570。

表6 双荧光素酶报告试验(±s)Table 6 Double luciferase reporting tests

表6 双荧光素酶报告试验(±s)Table 6 Double luciferase reporting tests

注:与miR-NC 组相比, aP＜0.05。Note.Compared with miR-NC group, aP＜0.05.

组别Groups野生型宿主基因16 WT-SNHG16变异型宿主基因1 MUT-SNHG16 miR-NC 组miR-NC group 1.16±0.14 1.02±0.08 miR-570 组miR-570 group 0.50±0.10a 0.98±0.07 t 14.860 1.457 P＜0.001 0.156

2.6 过表达miR-570 干扰lncRNA SNHG16 对HepG2-R 细胞耐药性的影响

如表7,图5 所示,过表达lncRNASNHG16 可使HepG2-R 细胞中miR-570 表达下降(P＜0.05),与HepG2-R+pcDNA SNHG16 +miR-NC 组相比,HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 组的迁移细胞个数及CyclinD1、MMP-9、MMP-2 的表达水平升高,抑制率、凋亡率及P21 的表达水平降低,具有显著性差异(P＜0.05)。

图5 CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2 表达Western blot 图Figure 5 Western blot expression of CyclinD1, P21,MMP-9 and MMP-2

表7 过表达miR-570 干扰lncRNA SNHG16 对HepG2-R 细胞耐药性的影响(±s)Table 7 Effect of overexpression of miR-570 interfering lncRNA SNHG16 on drug resistance of HepG2-R cells

表7 过表达miR-570 干扰lncRNA SNHG16 对HepG2-R 细胞耐药性的影响(±s)Table 7 Effect of overexpression of miR-570 interfering lncRNA SNHG16 on drug resistance of HepG2-R cells

注:与HepG2-R+pcDNA 组相比, aP＜0.05;与HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 组相比, bP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+pcDNA group, aP＜0.05.Compared with HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC group, bP＜0.05.

组别Groups HepG2-R+pcDNA 组HepG2-R+pcDNA group HepG2-R+pcDNA SNHG16 组HepG2-R+pcDNA SNHG16 group HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 组HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC group HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 组HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 group F P miR-570 0.93±0.13 0.44±0.07a 0.38±0.06 0.79±0.11b 14.880 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 13.29±1.12 45.35±3.76a 47.30±3.13 18.68±2.09b 39.620 ＜0.001凋亡率(%)Apoptosis rate 17.95±2.11 20.46±2.87a 29.40±3.06 17.75±2.09b 11.930 ＜0.001 N迁um移be的r o细f m胞ig个ra数ted(c n e)lls 90.48±8.29 50.21±6.75a 47.37±5.42 80.54±7.67b 16.860 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.71±0.07 0.25±0.03a 0.24±0.04 0.62±0.06b 22.580 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗体0.31±0.03 0.72±0.08a 0.76±0.09 0.45±0.05b 18.370 ＜0.001基质金M属MP蛋-9白酶90.68±0.07 0.29±0.04a 0.25±0.03 0.54±0.05b 21.870 ＜0.001基质金M属MP蛋-2白酶20.80±0.09 0.36±0.05a 0.32±0.03 0.60±0.07b 19.600 ＜0.001

3 讨论

肝癌在每个年龄段都有可能会出现,各种类型肝炎病毒引起的慢性感染可致使机体发生慢性肝炎,伴随疾病的进展发展为肝癌,且肝内脂肪的积累、肝硬化或长时间进食霉变的食物等均与肝癌疾病发生有着紧密联系[7-8]。

化疗是临床治疗癌症最基本的方案之一,临床救治失败主要因为化疗药物的耐药性产生、DNA 受损修复、药物的排外、细胞凋亡等因素互相作用,使耐药病理机制相对复杂[9]。 索拉非尼通过靶向多项相关靶点,可减缓肿瘤细胞的增殖及新生血管的产生,发挥对肝癌抑制的效果,并且该药物为首要诊治晚期肝癌的靶向药物,能有效改善预后[10-11]。研究发现,上皮间质的转化、肿瘤的微环境及信号通路等可能会与索拉非尼的耐药有关[12-13]。 本文研究发现肝癌细胞HepG2 与lncRNA SNHG16 对索拉非尼耐药有一定的关联性,说明lncRNA SNHG16对miR-570 进行调控可有助于缓轻肝癌细胞对索拉非尼耐药的预后。

研究显示,lncRNA 在肿瘤出现及进展中有一定的参与,lncRNA 也可对肝癌的转移起到调节作用[14-15]。 SNHG16 在乳腺癌、肝癌、结直肠癌等肿瘤组织及细胞中表达异常,与肿瘤细胞的侵袭、迁移及增殖相关[16-17]。 随着临床对miRNA 的研究不断加深,可知其能对多类肿瘤发挥出明显的调节作用,且在恶性肿瘤中表达异常,其主要的特异性常表现为对恶性肿瘤细胞增殖、分化的调控[18]。 研究显示,miR-570 可在肿瘤产生及进展中有所参与,且可有效调节肿瘤免疫有关的靶向基因,进而对肝癌细胞的侵袭、转移、增殖及凋亡的过程发挥一定的干预效果,同时可经调节B7-H1 基因进行靶向调控,抑制肝癌细胞的侵袭、增殖[19]。 研究发现,与人体正常的肝组织比较,肝癌细胞组织中的lncRNA SNHG16 表达升高,miR-570 呈低表达,且在HepG2-R+pcDNA SNHG16 组及HepG2-R+anti-miR-570 组中迁移细胞的个数及CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2、miR-570 的表达水平降低,lncRNA SNHG16、抑制率、凋亡率及P21 的表达水平升高;CyclinD1、MMP-9、MMP-2 的表达水平降低,抑制率、凋亡率及P21的表达水平升高,促进肝癌细胞的发展,经对lncRNA SNHG16 水平进行调控可有效改善HepG2-R 细胞耐药性,与其他学者研究较相似[20-21]。 表明lncRNA SNHG16 经调控miR-570 水平表达,可有效改善HepG2 细胞对索拉非尼耐药。

综上所述, 在肝癌细胞中分析 lncRNA SNHG16、miR-570 的作用,探究lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌病症中的病理机制,结果显示lncRNA SNHG16 在肝癌索拉非尼耐药细胞中呈高水平表达,经靶向调控miR-570 表达可有效促进索拉非尼的耐药性,为临床进一步分析肝癌索拉非尼耐药病理机制指明了方向。