金丝桃苷通过AMPK/mTOR/ULK1 信号通路对肾病综合征大鼠自噬反应的影响

孔露娇王 心刘 静郭晓阳薛明伟

(邢台市人民医院肾内科,河北 邢台 054000)

肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是由于基底膜受损和肾小球通透性增加等导致的临床综合征,多伴随水肿、蛋白尿和低白蛋白血症等症状,若不能有效纠正,可能导致感染、血栓形成、肾功能衰竭等,威胁患者生命[1]。 尽管多数患者对类固醇有反应,但是易复发,且长期服用类固醇的患者面临耐药、全身感染、骨质疏松等并发症的风险[2],因此,有必要开发新型治疗药物。 据报道,感染、过量药物等病理生理压力会导致足细胞损伤,损害肾小球的滤过功能,使得蛋白质等未经过滤直接进入尿液,导致蛋白尿症状[3-4]。 与NS 相对应的动物模型是目前国际公认的大鼠阿霉素肾性水肿模型,与临床NS 患者肾活检结果相似,是经典的研究NS 的动物模型,基于该模型可筛选治疗肾病相关中药的药效评价。 足细胞丢失后无法通过增殖恢复数量,但在其脱落前及时给予药物干预,能让足细胞恢复到健康状态[5]。 据报道,自噬功能障碍会导致足细胞损伤,而AMP 活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51 样自噬激活激酶1 (AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin/unc-51 like autophagy activating kinase 1, AMPK/mTOR/ULK1)通路的活化可诱导自噬[6],可能是防止足细胞衰老和损伤的保护机制,有望成为NS 的治疗策略。 金丝桃苷(hyperoside,Hyp)为桔梗科、豆科、金丝桃科等植物的天然活性物,具有抗炎、调节自噬、抑氧化及肾保护等活性[7]。 研究显示,Hyp 可通过抑制线粒体分裂减轻足细胞损伤,改善糖尿病肾病大鼠的肾炎症、肾小球硬化等损伤[8-9],但其对足细胞自噬的调节作用鲜见报道。 本研究拟构建NS 大鼠模型,探讨Hyp 对NS 大鼠足细胞自噬和AMPK/mTOR/ULK1 通路的影响,以进一步揭示Hyp 对NS的治疗机制,为Hyp 的开发提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

32 只雄性SD 大鼠,SPF 级,体重190 ～205 g,6 周龄(北京维通利华实验动物公司[SCXK(京)2019-0009])。 统一在河北医科大学实验动物中心[SYXK(冀)2020-0002]的动物房中分笼饲养,温度(25.0±1.0)℃、湿度(46.0±2.0)%,昼/夜循环设为12 h/12 h,确保自由获取水和食物。 本研究通过河北医科大学实验动物伦理委员会审批(IACUC-202103008)。 实验动物饲养和实验过程中按实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

金丝桃苷(Hyp,≥95%纯度)(美国Merck 公司,批号:20200405);AMPK 抑制剂Compound C(CC)(美国MCE 公司,批号:20200811);阿霉素(每支10 mg,深圳万乐药业有限公司,批号:1905E1);HE 试剂盒、电泳预制胶(上海碧云天生物技术有限公司,批号:C0105S、P0539S);兔源抗pAMPK、AMPK、微管相关蛋白轻链3(microtubuleassociated protein light chain 3,LC3)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、自噬相关蛋白5(Autophagy associated protein 5,Atg5)、Atg7、pmTOR、mTOR 抗体(美国CST公司,批号:#2535、#2532、#4108、#5174、#12994、#8558、#5536、#2983);兔源NPHS2、pULK1、ULK1 抗体、小鼠源Beclin-1 抗体、羊抗兔(Cy3)和羊抗小鼠(Alexa Flour 488)荧光二抗(美国Proteintech 公司,批号:20384-1-AP、29006-1-AP、20986-1-AP、66665-1-Ig、SA00009-2、SA00006-1)。 带荧光组件的光学显微镜(德国Leica 公司);7100 型全自动生化分析仪、透射电子显微镜(日本HITACHI 公司);全自动生化分析仪(美国BECKMAN 公司);转膜及电泳仪器(美国BioRad 公司);7500 型RT-qPCR 仪(美国ABI 公司);MDF-392 型超低温冰箱(日本SONY 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 NS 大鼠模型建立及分组

将6 周龄SD 大鼠适应喂养至7 周龄,分为正常组(N 组)、肾病综合征组(NS 组)、金丝桃苷组(Hyp组,60 mg/kg Hyp)、金丝桃苷+AMPK 抑制剂组(Hyp+CC 组,60 mg/kg Hyp+0.2 mg/kg CC),每组8只。 除N 组的8 只外,其他大鼠一次性尾静脉注射6.5 mg/kg 阿霉素建立NS 大鼠模型[10]。 末次阿霉素注射14 d 后,尾静脉采血检测血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)水平,并收集大鼠24 h 尿液,检测尿蛋白含量。以建模大鼠BUN 和Scr 水平显著高于N 组大鼠,且24 h 尿蛋白量＞100 mg 为模型复制成功。 实验共采用32 只大鼠造模,在造模过程中有5 只大鼠死亡,3 只大鼠造模失败,共成功造模24 只大鼠,模型成功率为75.0%。 Hyp 剂量(溶在1%羧甲基纤维素钠中)根据文献[9]和体表面积法确定为60 mg/kg 且预实验显示60 mg/kg Hyp 灌胃可有效减轻NS 大鼠肾损伤;抑制剂CC 剂量根据文献[11]确定为0.2 mg/kg,N 组和NS 组给予等量1%羧甲基纤维素钠灌胃和生理盐水腹腔注射。 每天1 次,连续14 d。

1.3.2 样本采集

给药结束后,收集24 h 尿液测定尿总蛋白(urine total protein,UTP);异氟醚麻醉大鼠后从颈动脉针刺采血,4℃离心(3000 r/min,15 min)收集血清,分装存在-80℃冰箱用于检测BUN、Scr 及白蛋白(albumin,ALB)水平;处死大鼠,剖腹取肾,剪下左肾纵剖为两半,一半甲醛固定并做石蜡切片(5 μm)用于HE 染色和免疫荧光染色,另一半戊二醛、锇酸固定并做超薄树脂切片用于透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)实验;剪碎右肾用RIPA 裂解液提取蛋白,分装、标记并存在-80℃冰箱用于Western blot 实验。

1.3.3 UTP、BUN、Scr 及ALB 水平测定

取尿液和血清样本,采用全自动生化分析仪检测24 h 尿液总蛋白(UTP)、BUN、Scr 和白蛋白(ALB)水平。

1.3.4 HE 染色观察肾组织病理变化

取肾石蜡切片,进行脱蜡复水后,采用苏木素染色和伊红染色,脱水封片后,在光镜下观察肾组织病理形态变化。

1.3.5 TEM 观察肾组织超微结构变化

将肾超薄树脂切片放在铜网上烙片,用醋酸铀和柠檬酸铅行双重染色,TEM 下观察肾小球超微结构,并用Image J 软件分别对每只大鼠某一肾切片电镜图的随机5 个视野下肾小球基底膜、足细胞突等超微结构进行分析,计算平均值。

1.3.6 Western blot 检测

将20 μg 肾蛋白样品冰上解冻、凝胶孔上样、恒压电泳、 恒流转聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜, 取 封 闭 后 的 膜 与 pAMPK、AMPK、GAPDH、LC3、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2、pmTOR、mTOR 特异性一抗孵育(4℃过夜),之后与二抗孵育(室温1.5 h),用化学发光液显示条带,在凝胶成像系统的暗盒中曝光拍照,分析相对灰度(以GAPDH 为内参)。

1.3.7 免疫荧光染色

肾石蜡切片经烤片、抗原修复、封闭混杂抗原表位等处理后,滴加小鼠源Beclin-1、兔源NPHS2 特异性一抗孵育(4℃过夜),次日滴加羊抗兔(Cy3)和羊抗小鼠(Alexa Flour 488) 荧光二抗避光孵育50 min,接着加DAPI 染细胞核后封片,荧光显微镜下(同样曝光时间)观察拍照。 绿色荧光的Beclin-1+小泡为自噬体,红色荧光的NPHS2+细胞为足细胞,Image J 随机统计每只大鼠某一肾切片荧光图的随机5 个视野肾小球区域的荧光强度,计算平均值。

1.4 统计学方法

数据使用GraphPad Prism 8.0 软件进行分析和作图,计量资料用平均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hyp 对生化指标的影响

相比于N 组,NS 组UTP、BUN、Scr 水平显著增高,ALB 水平显著降低(P＜0.05);相比于NS 组,Hyp 组UTP、BUN、Scr 水平显著降低,ALB 水平显著增高(P＜0.05);相比于Hyp 组,Hyp+CC 组UTP、BUN、Scr 水平显著增高,ALB 水平显著降低(P＜0.05),见表1。 提示Hyp 可改善NS 大鼠肾小球滤过功能。

表1 各组UTP、BUN、Scr 和ALB 水平比较(±s,n=8)Table 1 Comparison of UTP、BUN、Scr and ALB levels among groups

表1 各组UTP、BUN、Scr 和ALB 水平比较(±s,n=8)Table 1 Comparison of UTP、BUN、Scr and ALB levels among groups

注:与正常组比较, *P＜0.05;与肾病综合征组比较, #P＜0.05;与金丝桃苷组比较, ▲P＜0.05。Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group, #P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.

组别Groups尿总蛋白(mg)UTP血尿素氮(mmol/L)BUN血清肌酐(μmol/L)Scr白蛋白(g/L)ALB正常组N group 6.28±1.47 4.27±1.05 28.61±2.53 43.89±4.16肾病综合征组NS group 45.37±5.46* 6.86±1.16* 46.02±4.17* 19.46±2.53*金丝桃苷组Hyp group 20.75±3.52# 4.51±0.73# 31.38±3.76# 37.68±3.17#金丝桃苷+AMPK 抑制剂组Hyp+CC group 39.64±4.27▲ 6.63±0.94▲ 40.42±4.28▲ 25.74±3.02▲

2.2 Hyp 对肾组织形态的影响

如图1 所示,N 组肾小球、肾小管形态完整、结构清晰;NS 组肾小球体积变大、系膜基质增生、大量肾小管空泡变性;Hyp 组肾形态明显恢复;与Hyp组比较,Hyp+CC 组肾病理形态损伤加重,肾小管空泡变性增多。 提示Hyp 可减轻NS 大鼠肾组织损伤。

图1 各组肾组织学观察(HE 染色)Figure 1 Histological observation of the renal issue among groups (HE staining)

2.3 Hyp 对肾小球超微结构的影响

如图2,表2 所示,TEM 下可见NS 大鼠基底膜普遍增厚,足细胞肿胀,足突消失、散开或融合。 量化分析显示,相比于N 组,NS 组基底膜厚度和足突宽度显著增加(P＜0.05);相比于NS 组,Hyp 组基底膜厚度和足突宽度显著降低(P＜0.05);相比于Hyp 组,Hyp+CC 组基底膜厚度和足突宽度显著增高(P＜0.05)。提示Hyp 可减轻NS 大鼠肾组织肾小球损伤。

图2 各组肾小球透射电镜图Figure 2 Representative image of glomerular transmission electron microscope

表2 各组基底膜厚度和足突宽度比较(±s,n=8)Table 2 Comparison of glomerular basement membrane thickness and foot process width among groups

表2 各组基底膜厚度和足突宽度比较(±s,n=8)Table 2 Comparison of glomerular basement membrane thickness and foot process width among groups

注:与正常组比较, *P＜0.05;与肾病综合征组比较, #P＜0.05;与金丝桃苷组比较, ▲P＜0.05。Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group,#P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.

组别Groups肾小球基底膜厚度(μm)Glomerular basement membrane thickness足突宽度(μm)Foot process width正常组N group 0.22±0.06 0.14±0.03肾病综合征组NS group 0.34±0.08* 0.21±0.04*金丝桃苷组Hyp group 0.25±0.05# 0.16±0.04#金丝桃苷+AMPK抑制剂组Hyp+CC group 0.31±0.09▲ 0.20±0.05▲

2.4 Hyp 对自噬蛋白和足细胞蛋白的影响

如图3 所示,NS 组LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1、Atg5、Atg7 和NPHS2 蛋白水平显著低于N 组(P＜0.05);Hyp 组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 和NPHS2 蛋白水平显著增高于NS 组(P＜0.05);而Hyp + CC 组 LC3-Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1、 Atg5、 Atg7 和NPHS2 蛋白水平显著低于Hyp 组(P＜0.05)。 提示Hyp 可提高NS 大鼠肾组织自噬水平。

注:与正常组比较, *P＜0.05;与肾病综合征组比较, #P＜0.05;与金丝桃苷组比较, ▲P＜0.05。图3 Western blot 检测LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 及NPHS2 蛋白表达Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group, #P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.Figure 3 The level of LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 and NPHS2 protein detected by Western blot

2.5 免疫荧光观察自噬体和足细胞在肾小球中的定位

如图4、图5 所示,足细胞采用NPHS2 抗体标记,呈红色荧光;自噬体采用Beclin-1 抗体标记,呈绿色荧光,绿色荧光主要集中在红色荧光附近。 NS组NPHS2、Beclin-1 相对荧光强度弱于N 组(P＜0.05);Hyp 组NPHS2、Beclin-1 蛋白相对荧光强度强于NS 组(P＜0.05);Hyp+CC 组NPHS2、Beclin-1相对荧光强度弱于Hyp 组(P＜0.05)。 提示Hyp 可增强NS 大鼠肾组织足细胞自噬。

图4 自噬体和足细胞标记蛋白的免疫荧光染色图Figure 4 Representative images of immunofluorescence staining for autophagosome and podocyte marker proteins

注:与正常组比较, *P＜0.05;与肾病综合征组比较, #P＜0.05;与金丝桃苷组比较, ▲P＜0.05。图5 各组NPHS2、Beclin-1 相对荧光强度比较Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group,#P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.Figure 5 Comparison of relative fluorescence intensity of NPHS2 and Beclin-1 among groups

2.6 Hyp 对AMPK/mTOR/ULK1 通路的影响

如图6 所示,相比于N 组,NS 组p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 比 值 显 著 降 低, p-mTOR/mTOR 比值显著增加(P＜0.05);相比于NS 组,Hyp组p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 水平显著增加,p-mTOR/mTOR 比值显著降低(P＜0.05);相比于Hyp 组,Hyp+CC 组p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低,p-mTOR/mTOR 比值显著增加(P＜0.05)。 提示Hyp 可激活NS 大鼠肾组织AMPK/mTOR/ULK1 通路。

注:与正常组比较, *P＜0.05;与肾病综合征组比较, #P＜0.05;与金丝桃苷组比较, ▲P＜0.05。图6 Western blot 检测AMPK/mTOR/ULK1 通路蛋白水平Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group, #P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.Figure 6 Level of AMPK/mTOR/ULK1 pathway protein deteced by Western blot

3 讨论

NS 肾损伤涉及炎症、氧化、自噬等参与,类固醇等药物为主要治疗药物,但对器官实质性损伤的改善效果有限。 阿霉素是一种含醌式结构的抗肿瘤药物,在体内药物代谢酶的作用下,形成半醌自由基,半醌自由基与氧化反应生成超氧阴离子和羟自由基,两者可通过膜的脂质过氧化作用,对肾造成损伤,从而诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应,破坏滤过膜结构和功能,产生蛋白尿,并导致肾小管和肾小球发生病理变化[10]。 尾静脉注射阿霉素是制作NS 大鼠模型常用的造模方法,具有操作简单、成模较快、动物死亡率低等优点,已被广泛应用于NS 治疗药物的药效学研究[12]。 在本研究中,模型组大鼠在造模后第15 天24 h 尿蛋白含量、BUN和Scr 水平显著高于正常大鼠,表明成功复制阿霉素肾病模型。 Hyp 已被证实具有保护肾细胞免于氧化损伤[13]、抑制缺血再灌注造成的肾细胞凋亡[7]、预防糖尿病相关肾小球基底膜损伤[14]等作用,因此Hyp 可作为肾保护药物。 本研究与Zhou 等[9]研究一致,Hyp 可降低NS 大鼠UTP、BUN、Scr 和ALB 水平,减轻肾小球体积变大、肾小管萎缩、足细胞肿胀、足突消失等损伤,表明Hyp 可恢复足细胞形态,提高肾小球滤过功能,对NS 大鼠肾损伤有保护作用。

足细胞为一类有很多足突的无法增殖且高度特化上皮细胞,包围着肾小球基底膜、毛细血管等组成滤过屏障,其稳态和完整性依赖于较高的基础自噬水平[15]。 研究已指出,自噬水平的变化与足细胞稳态密切相关,并参与多种肾病的发展[16-17]。 细胞质中的LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合并转变为膜型LC3-Ⅱ,是自噬体膜形成的关键标志[18];在ATG家族蛋白的作用下自噬体膜进一步延伸[18];另外,Beclin-1 也可通过招募其他自噬蛋白参与自噬过程的启动[19]。 因此,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和ATG 蛋白表达增加提示自噬激活。 在本研究中,NS 大鼠LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 蛋白水平降低;同时足细胞特异蛋白NPHS2 表达降低。 推测NS 组大鼠的肾自噬活性不足,导致受损细胞器、蛋白质等在足细胞中不断积累,损害足细胞。 而给予Hyp 干预后,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 蛋白水平和NPHS2 表达均升高,提示Hyp 可增强NS 大鼠自噬活性,恢复足细胞稳态,减轻足细胞损害。 另外,免疫荧光半定量分析显示,肾组织中NPHS2 和Beclin-1 的荧光总量均呈NS 组、Hyp 组、N 组依次增 高 趋 势, 与 Western blot 结 果 趋 势 相 符, 且Beclin-1+的绿色自噬体主要分布在NPHS2+的红色足细胞周围,佐证了足细胞是自噬活性增强的主要受益者。

自噬可作为适应性应激,促进对有害物质的清除,减轻细胞损伤或死亡[20]。 AMPK/mTOR/ULK通路是重要的自噬通路之一,其中AMPK 为主要的能量传感器,通过直接磷酸化并活化ULK1 来维持细胞的能量代谢、促进自噬并维持细胞稳态[21]。 而mTOR 也通过磷酸化活化,活化的mTOR 可抑制ULK1 的激活,是自噬过程的关键负调节剂[22]。AMPK/mTOR 通路已被证实参与肾病大鼠的自噬进程,AMPK/mTOR 通路的激活有利于自噬体的形成、足细胞的恢复和肾病理损伤的改善[11,23]。 Hyp 对自噬具有双重调节作用,一方面Hyp 可通过抑制AMPK-ULK1 介导的自噬来减轻D-半乳糖诱导的肾衰老和损伤[24];另一方面Hyp 可通过激活沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,Sirt1)/AMPK 信号通路,促进自噬,改善糖尿病骨质疏松大鼠骨代谢[25];在皮肤癌中,Hyp 可激活AMPK 信号,诱导癌细胞自噬和凋亡,抑制增殖[26]。 本研究中,给予Hyp 干预后大鼠p-AMPK/AMPK 和p-ULK1/ULK1 水平增加,p-mTOR/mTOR 水平降低,结合Hyp 可增加LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和ATG 蛋白水平的结果,提示Hyp 可促进NS 大鼠体内的AMPK/mTOR/ULK1 自噬通路活化。 此外,在Hyp 的基础上采用AMPK/mTOR 通路抑制剂CC 抑制AMPK/mTOR/ULK1 通路的活化,结果显示,CC 可减弱Hyp 的足细胞保护作用及促自噬作用,部分抵消Hyp 对NS 的改善效果,验证了AMPK/mTOR/ULK1通路的活化在Hyp 保护NS 大鼠足细胞损伤中发挥了积极作用。 本研究结果表明Hyp 在NS 中通过激活AMPK 信号发挥促自噬作用,推测Hyp 对自噬是发挥抑制或促进作用,可能与疾病种类及病程有关,不同疾病或同一疾病在不同时期其自噬水平是不同的。

综上所述,Hyp 可通过促进肾细胞自噬,减轻足细胞损伤实现对NS 的治疗作用,其中AMPK/mTOR/ULK1 通路为其促进自噬的重要靶点。 下一步将分离足细胞,进一步探讨Hyp 对足细胞自噬的作用机制。