基于Box-Benhnken 响应面法优化红花籽油超声回流提取工艺

魏 伟，蔺发聪，侯建忠，朱顺娟，吕培霖*

（1.酒泉市药品检验检测中心,甘肃 酒泉 735000；2.联勤保障部队第九四四医院 药剂科，甘肃 酒泉 735000）

红花籽为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的种子[1]，又叫“白平子”“血平子”，富含油脂，经加工得到的红花籽油，主要含有亚油酸、维生素 E 、棕榈酸、β-胡萝卜素等多种生物活性物质[2-3]，其中亚油酸含量可达60% ～ 80%，有“亚油酸之王”的称号。研究表明，红花籽油具有降血脂、降低胆固醇、预防和治疗动脉粥样硬化的功效，有“人体血管清道夫”的美誉，另外还有抗炎、增强细胞代谢、延缓衰老的作用[4-5]，是一种营养丰富、保健功能优良高品质的食用植物油。目前，红花籽油的加工方式有压榨法、水酶法、有机溶剂浸提法、超临界CO2萃取法等[6]，与传统压榨法相比较，有机溶剂超声浸提法具有提取效率高，提取时间短，提取油品质量高的特点。本研究在单因素试验的基础上，以红花籽油提取率、综合评分为考察指标，以液料比、超声提取时间、提取温度为变量因素，采用Box-Benhnken 响应面法考察优化了红花籽油超声溶剂回流提取工艺参数，为后期扩大生产和开发利用提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪（包括四元低压泵、自动进样器、柱温箱、紫外可见检测器，日本岛津公司）；XP205DR 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；KH-250B 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；EV351 型旋转蒸发仪（广州博勒泰科技有限公司）。

1.2 试药

亚油酸对照品（批号：B21412，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈、甲醇为色谱纯；石油醚（30 ～ 60℃）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 红花籽油的提取

取红花籽粉末（过一号筛）约15 g，精密称定，置连接冷凝装置的圆底烧瓶中，加入规定液料比的石油醚（30 ～ 60℃，下同），在规定的提取温度、提取时间内超声（功率：250 W，频率：40 kHz）提取，放冷后过滤，减压回收石油醚至不再有液滴溜出后继续蒸馏3 min，剩余提取物即为红花籽油，精密称定重量，计算红花籽油提取率，公式为：

2.2 亚油酸含量测定

2.2.1 色谱条件 采用InertSustain C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5μm），乙腈-0.1%磷酸溶液（85 : 15）为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；检测波长为207 nm；进样体积为10 μL，色谱峰理论板数均不低于4 000[7-8]。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取亚油酸对照品0.141 67 g，置磨口三角瓶中，加入0.5 mol/L NaOH 甲醇溶液20 mL，连接冷凝装置，60℃回流提取30 min至油滴完全消失，冷却至室温，加酚酞指示液2 滴，滴加0.5 mol/L 盐酸溶液至红色褪去，再将上述溶液转移至50 mL 容量瓶中，并用甲醇洗涤三角瓶3 次，合并洗涤液至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm 有机微孔滤膜，取续滤液测定。

2.2.3 供试品溶液制备 取“2.1”项下红花籽油约0.2 g，精密称定，置磨口三角瓶中，加入0.5 mol/L NaOH 甲醇溶液20 mL，按照“2.2.2”项下方法处理。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液，“2.2.3”项下供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进样，结果见图1。阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，测得亚油酸峰面积的RSD 为0.78%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批红花籽油，按照“2.2.3”项下方法制备6 份平行供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算样品中亚油酸含量的RSD 为1.48%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、24 h 各进样1 次，记录色谱图，测得亚油酸峰面积的RSD 为0.86%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液1、3、5、8、10 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到质量浓度分别为0.283 3、0.850 0、1.416 7、2.266 7、2.833 4 mg/mL 的系列标准溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，进样质量浓度（X，mg/mL）为横坐标进行线性回归，得到亚油酸的回归方程为Y=8.917 49×106X+3.054 7×106（r= 0.998 9）。表明亚油酸在0.283 3 ～ 2.833 4 mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取已知亚油酸含量的红花籽油样品9 份，分别按加入50%、100%、150% 的亚油酸对照品各3 份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算亚油酸的平均回收率为96.28%，RSD 为1.93%。表明方法符合要求。

2.4 单因素试验

2.4.1 超声提取时间的影响 按“2.1”项下红花籽油的提取方法，石油醚作为提取溶剂，加入10 倍提取溶剂，提取温度为30℃，超声提取时间分别为10、20、30、40、50 min，考察对红花籽油提取率的影响，结果见图2A。结果为超声提取时间30 min 时红花籽油提取基本完全，考虑到效率和能耗问题，选定超声提取时间为30 min。

图2 单因素试验结果Fig.2 Single factor test results

2.4.2 液料比的影响 按“2.1”项下红花籽油的提取方法，以石油醚作为提取溶剂，超声提取温度和时间分别为30℃和30 min，加入提取溶剂分别为10倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍，考察对红花籽油提取率的影响，结果见图2B。结果为加入20 倍提取溶剂时红花籽油的提取趋于最大，故选定加入提取溶剂为20 倍。

2.4.3 提取温度的影响 按“2.1”项下红花籽油的提取方法，石油醚作为提取溶剂，加入20 倍提取溶剂，提取时间为30 min，提取温度分别为20、30、40、50、60℃，考察对红花籽油提取率的影响，结果见图2C。结果为提取温度40℃时红花籽油提取率最高，故选定超声提取温度为40℃。

2.5 Box-Behnken 响应面法优选提取参数

2.5.1 综合评分计算方法 将红花籽油提取率、亚油酸含量进行标准化处理，公式为：

X=(x-xmin)/(xmax-xmin)×100% （2）

其中，X为标准化处理后数值，x为该组的实测数值，xmax为该组数据中最大数，xmin为该组数据中最小数。

综合评分为红花籽油提取率、亚油酸含量标准化处理后数值与相应的权重系数相乘后的和。红花籽油提取率、亚油酸含量的权重系数分别为0.6、0.4。

2.5.2 试验设计与结果 参照单因素试验结果，选取液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）三个因素，确定三水平，见表1，采用Design Expert 8.0.6软件设计试验，试验设计及结果见表2。

表1 红花籽油超声提取试验因素与水平表Tab.1 Factors and level table for ultrasonic extraction of Carthami semen oil

表2 红花籽油超声提取试验设计与结果Tab.2 Experimental design and results of ultrasonic extraction of Carthami semen oil

2.5.3 建立模型与方差分析 以红花籽油提取率为考察目标，采用Design Expert 8.0.6 软件对红花籽油超声溶剂提取工艺结果进行二次多元拟合分析，得到回归方程：红花籽油提取率=17.39+0.33A+0.67B+0.58C+0.05AB+0.27AC-0.34BC-1.82A2+0.30B2-1.02C2。

红花籽油超声溶剂法提取工艺方差分析结果见表3。从表中结果可知，此模型具有极好的显著性（P＜0.001），模型失拟项不显著（P= 0.869）,表明模型方程拟合度较高，可用于分析和预测红花籽油超声溶剂提取工艺参数。预测R2为0.991 7 与校准的0.994 9 基本一致，变异系数CV = 0.58%＜10%，信噪比为51.485 ＞4，说明模型试验的稳定性好，误差小。从P值可知，一次项A、B、C，交互项AC、BC，二次项A2、B2、C2对综合评分的影响极显著，其他项影响不显著；从F值可知一次项因素对红花籽油提取率的影响顺序为：B＞C＞A，即提取时间＞提取温度＞液料比。

表3 红花籽油提取率方差分析结果Tab.3 Analysis of variance of extraction rate of Carthami semen oil

以红花籽油提取率和亚油酸含量的综合评分为考察目标，采用Design Expert 8.0.6 软件对红花籽油超声溶剂提取工艺结果进行二次多元拟合分析，得到回归方程：综合评分= 89.25+5.38A+5.38B-1.94C+0.70AB+2.19AC-5.59BC-31.69A2+2.68B2-26.60C2， 红花籽油超声溶剂法提取工艺方差分析结果见表4。从表中结果可知，此模型具有极好的显著性（P＜0.001），模型失拟项不显著（P= 0.109）,表明模型方程拟合度较高，可用于分析和预测红花籽油超声溶剂提取工艺参数。预测R2为0.842 1 与校准的0.970 8 基本一致，变异系数CV = 6.19%＜10%，信噪比为22.643 ＞4，说明模型试验的稳定性好，误差小。从P值可知，一次项A、B，二次项A2、C2对综合评分的影响极显著，交互项BC 对综合评分的影响显著，其他项影响不显著；从F值可知一次项因素对综合评分的影响顺序为：A＞B＞C，即液料比＞提取时间＞提取温度。

表4 红花籽油超声工艺综合评分方差分析结果Tab.4 Analysis of variance of ultrasonic comprehensive score for Carthami semen oil

2.5.4 交互作用响应面分析 以单因素A、B、C中任意2 个变量对红花籽油提取率和综合评分的影响，采用Origin 2018 软件绘制等高线图和3D 响应面图，结果见图3、4。提取时间与提取温度的交互作用对红花籽油提取率和综合评分的影响最大，液料比与提取时间的交互作用影响最小。

图3 交互作用对红花籽油提取率影响的响应面图Fig.Response surface diagram of interaction effect on Carthami semen oil extraction

图4 交互作用对综合评分影响的响应面图Fig.3 Effect of interaction on comprehensive score response surface

2.6 验证试验

通过软件分析，以红花籽油提取率为考察目标，最优提取参数为：液料比为19.47 : 1，提取时间为39.91min，提取温度为49.79℃，红花籽油提取率理论值为17.28%。以综合评分为考察目标，最优提取参数为：液料比19.39 : 1，提取时间为36.19 min，提取温度为38.16℃，综合评分理论值为92.57。为检验试验结果的可靠性，考虑到试验条件和操作的便利性，确定最佳提取工艺为：液料比为20 : 1，提取时间为35 min，提取温度为40℃。采用上述试验参数重复提取3 次，实际测得红花籽油平均提取率为17.15%，综合评分为90.34，与理论值基本一致，相对误差分别为0.75%、2.47%。表明优化后的试验条件可靠，具有应用价值。

3 讨论

亚油酸的测定有HPLC 法、GC 法[9-11]，GC 法适合分析分子量较小，易气化的物质,亚油酸经皂化处理后可采用GC 法分析。课题组分别建立了HPLC 法和GC 法测定红花籽油中亚油酸含量的方法，通过方法学考察发现HPLC 法各项指标优于GC 法。样品采用氢氧化钠甲醇溶液皂化处理后，色谱峰更加对称、尖锐，故采用HPLC 法测定红花籽油中亚油酸的含量。红花籽油含有多种不饱和脂肪酸，易受到光线、温度、氧气等因素的影响而引起质量的变化，优化红花籽油超声回流提取工艺时，不能只注重红花籽油提取率的多少，还应考虑提取工艺对其内在活性成分的影响，本研究选取红花籽油中含量最高的亚油酸为不饱和脂肪酸代表，将红花籽油提取率和亚油酸的含量按不同权重计算综合评分，以综合评分为指标优化提取工艺，既注重了红花籽油提取率，又关注了红花籽油中活性成分的多少，使得优化的红花籽油提取工艺更加的科学、合理。

Box-Behnken 响应面法是一种常用的工艺参数优化方法，可以评估各参数的非线性影响及交互影响，能够预测最佳工艺参数[12]。课题组在单因素试验的基础上，以红花籽油提取率和亚油酸含量的综合评分为考察指标，采用Box-Behnken 响应面法优化了红花籽油超声回流提取的重要影响参数，采用多元二次回归方程得到了最优提取工艺参数，经试验验证与理论值基本一致，表明回归模型方程能够很好地预测红花籽油超声回流提取工艺结果。

4 结论

本研究以红花籽油提取率和亚油酸含量的综合评分为指标，采用Box-behnken 响应面法优化的红花籽油超声回流提取工艺，为后期的开发利用奠定了理论基础。为了解决红花籽油易氧化变质、不利于保存的问题，课题组后期拟制备红花籽油水包油型乳剂，考察β-环糊精包和技术，将红花籽油进一步应用于药品、保健食品等领域。