牡蛎诺如病毒受体类Lewis 抗原合成相关基因CgFUT5 的克隆与表达鉴定

桂彬彬，曲 梦，张蔚然,3，李明玉,4，江艳华，姚 琳，王联珠

1.中国水产科学研究院黄海水产研究所/农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，山东 青岛 266071

2.大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034

3.上海海洋大学 食品学院，上海 201306

4.中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266003

诺如病毒是人类所有年龄组急性肠胃炎散发和暴发的重要原因[1-3]，具有高度传染性，10～100 个病毒颗粒即可引发感染[3]。在进入人体后，诺如病毒会特异性地与肠道中的附着因子结合，导致胃肠炎[4]。组织血型抗原 (Histoblood group antigcns,HBGAs) 已被确定为多种诺如病毒毒株的附着因子[5]。作为一种滤食性双壳软体动物，在被病毒污染的水体中，牡蛎体内的诺如病毒含量比环境中的高100 倍，病毒进入其体内难以被清除[6-7]，因此牡蛎被认为是诺如病毒的重要传播媒介[8]。多项研究指出，诺如病毒在牡蛎中的富集是由于其能与牡蛎消化道中的碳水化合物特异性结合，而这些碳水化合物具有类似于人类HBGAs 的结构[9-11]。因此，有理由假设牡蛎中可能存在与人HBGAs相似的合成途径和关键基因。

Lewis 抗原作为HBGAs 的一种，已经在微生物黏附和癌症转移等领域得到了深入研究[12-16]，Lewis 抗原在多种糖基转移酶依次催化下合成[17]，根据不同岩藻糖基转移酶的底物特异性，将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至不同的前体寡糖上，产生不同类型的Lewis 抗原。在人类基因组中，FUT5基因的转录产物是合成Lewis 抗原的糖基转移酶之一，属于α-1,3/4-岩藻糖基转移酶 (α-1,3/4 fucosyl transferases,α-1,3/4 Fuc Ts)[18]，同属于这一类糖基转移酶的还有FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10 和FUT11[19-20]。FUT5 偏好于在二型前体的基础上合成LeX和sLeX抗原，也有研究表明FUT5 还参与合成Lea、Leb和sLea抗原[21]。Lewis 抗原在诺如病毒结合过程中起重要作用，这些经岩藻糖基化产生的碳水化合物可以和人A/H 型HBGAs 抗原在结合诺如病毒时产生竞争性抑制[22]，在对牡蛎类HBGAs 的研究中也有类似发现[23]。

目前已经证实牡蛎中存在Lewis 抗原，种类包括Lea、Leb、LeX和LeY等[24]，然而未见具体合成途径及关键基因的研究。本研究克隆了太平洋牡蛎 (Crassostreagigas)FUT5基因，通过荧光定量法检测了太平洋牡蛎各组织中FUT5基因的表达量，探讨太平洋牡蛎FUT5基因的组织表达差异性，旨在为牡蛎富集诺如病毒的分子机理研究提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

鲜活太平洋牡蛎 (体长10～13 cm) 样本 (10 只) 采集自青岛市黄岛区某贝类养殖场。

1.2 总RNA 提取与cDNA 模板制备

取牡蛎消化腺组织，在液氮中研磨，根据试剂盒的操作说明，用动物组织RNA 提取试剂盒 (天根生化科技有限公司，中国) 制备牡蛎消化腺总RNA。用1% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。用Nano Photometer Pearl 微分光光度计 (Implen，德国) 测定RNA 浓度。使用SMATER RACE 5'/3' 试剂盒 (TaKaRa，中国) 对总RNA 进行逆转录合成5'/3' cDNA 末端 (RACE)，使用Evo M-MLV Plus cDNA 合成试剂盒 (艾科瑞生物工程有限公司，中国) 对总RNA 逆转录合成1st Strand cDNA。

1.3 中间片段克隆

根据NCBI 公布的人 (Homosapiens,NC_000019.10)、黑猩猩 (Pantroglodytes,NC_036898.1)、热带爪蟾 (Xenopus tropicalis,NC_030680.2)、狗 (Canislupusfamiliaris,NC_051824.1) 等物种的FUT5基因序列，使用DNAMAN 软件进行多序列比对，选取相似度较高的氨基酸序列在NCBI 网站上公布的太平洋牡蛎全基因组中搜索比对，找到预测的太平洋牡蛎FUT5(CgFUT5) 基因序列(XM_020069167.2)。利用Primer 5 软件设计中间片段扩增引物FT5-1 和RT5-1 (表1)，以太平洋牡蛎消化腺总RNA 反转录合成的1st Strand cDNA 为模板，扩增CgFUT5基因中间片段。PCR 反应体系 (50 μL) 为：FT5-1、RT5-1 (10 μmol·L-1) 各1 μL，PCR 预混液25 μL，cDNA 模板3 μL，RNase free water 20 μL。反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 5 min。PCR 产物经1% (w) 琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像仪对电泳条带进行观察，选择合适条带进行切胶并送至测序公司测序。

表1 实验中所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.4 基因全长克隆

根据中间片段克隆得到的序列，使用Primer 5 软件设计RACE 克隆引物FRT5/RRT5 (表1)。以SMATER RACE 5'/3' 试剂盒合成的cDNA 做模板，扩增5'/3' 序列。反应体系为：RNase Free Water 15.5 μL，2×seqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA polymerase 1 μL，5'/3' RACE cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，RRT5/FRT5 1 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35 个循环；72 ℃5 min。

将RACE PCR 产物经1% (w) 琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化后克隆到pUC19 线性载体上。将重组载体转化到TOP10 感受态细胞，并进行蓝白斑筛选和PCR 鉴定。选择结果良好的克隆送至测序公司测序。

1.5 序列分析

分析测序结果，将中间片段及5'、3' 序列拼接，得到完整的CgFUT5基因序列。使用Snapgene 软件预测氨基酸序列并计算出分子量和等电点；运用TMHMM 在线系统(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析蛋白质跨膜结构域；利用DNAMAN 软件进行多序列比对，在MEGA 7.0 软件中采用邻接法进行序列比对，构建系统发育树。

1.6 组织表达分析

取3 只牡蛎的外套膜、鳃、闭壳肌、唇瓣和消化腺组织，在液氮中研磨混合，提取各组织总RNA，使用RT-qPCR反转录试剂盒 (TaKaRa，中国) 制备荧光定量cDNA 模板。根据CgFUT5基因序列合成引物Q-FT5-A/Q-RT5-A (表1)，以太平洋牡蛎β-actin基因 (NCBI 网站登录号AF026063) 为内参基因，设计引物F-actin/R-actin (表1)[25-26]。通过RTqPCR 检测牡蛎外套膜、鳃、闭壳肌、唇瓣和消化腺中的CgFUT5基因表达水平，每个组织样品设置3 个平行组，反应体系为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s (收集荧光信号)，40 个循环。组织相对表达量使用2-ΔΔCt方法计算[27]。

1.7 原核表达

对前期克隆得到的CgFUT5基因序列依据大肠杆菌密码子偏好性进行稀有密码子优化，使用金斯瑞密码子优化工具 (https://www.genscript.com.cn/gensmart-free-genecodon-optimization.html) 在线进行。优化后的基因序列在氨基酸序列C 端添加6×His 标签序列，克隆至pET-28a(+) 质粒，得到的重组质粒命名为pET-CgFUT5。同时构建截断N 端部分氨基酸序列并添加6×His 标签序列，克隆至pET-28a(+) 质粒，得到的重组质粒命名为pET-His-Δ59-CgFUT5。

将pET-CgFUT5 与pET-His-Δ59-CgFUT5 质粒分别转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞，经卡那霉素筛选后挑取单菌落接种于含50 μg·mL-1卡那霉素的液体LB 培养基，经36 ℃摇床过夜培养后按体积比1∶50 转移至含有卡那霉素的TB 培养基中扩大培养。至菌液OD600为0.6 时，加入终浓度为0.6 mmol·L-1的IPTG 溶液，设置培养温度为36 ℃，培养时间为6 h。取1 mL 诱导后的菌液离心并收集菌体沉淀。加入80 μL 双蒸水 (ddH2O) 重悬菌体沉淀后，加入20 μL 5×蛋白上样缓冲液吹打混匀，煮沸10 min 以裂解细菌，12 000 r·min-1离心2 min，取10 μL 上清液加入聚丙烯酰胺体积分数为12%的SDS-PAGE 凝胶上样孔中，同时加入蛋白标准Marker、BL21 空菌阴性对照和pET28a 空载阴性对照组菌液。在垂直电泳仪 (百晶生物有限公司，中国) 中经120 V 电压分离后，取胶块置于室温摇床中用考马斯亮蓝染色液染色1 h，再经脱色液充分脱色至蛋白条带清晰可见。

1.8 免疫印迹分析

取1 mL 成功表达CgFUT5 蛋白的菌液，离心收集菌体后按体积比8∶2 加入ddH2O 和蛋白上样缓冲液，经煮沸离心后进行SDS-PAGE 电泳，同时加入蛋白Marker 和pET28a 空载阴性对照菌液。电泳完成后在30 V 恒定电压下转移蛋白至硝酸纤维素薄膜，置于预冷的TBS 缓冲液中洗涤后，转移至含有1% (w) 牛血清白蛋白 (BSA) 的TBST 缓冲液中，于4 ℃冰箱孵育过夜。用TBST 缓冲液洗涤过夜孵育后的硝酸纤维素薄膜3 次，加入兔抗人FUT5 单克隆抗体 (ABnova，中国) (使用TBST 缓冲液稀释2 000 倍)，同时在另一组加入鼠抗6×His 标签单抗体(Abcam，中国) (使用TBST 缓冲液稀释3 000 倍)，室温孵育2 h。孵育结束后使用TBST 缓冲液洗涤薄膜3 次，加入对应的二抗 (使用含1% BSA 的TBST 缓冲液稀释3 000 倍)室温孵育1 h，用TBST 缓冲液洗涤薄膜3 次。按照HRPDAB 底物显色试剂盒 (天根生化科技有限公司，中国) 说明书配制显色液，将显色液滴加于洗涤后的硝酸纤维素薄膜表面，避光放置5 min 显色。

2 结果

2.1 CgFUT5 基因全长序列

根据设计的中间片段引物FT5-1/RT5-1，扩增得到932 bp 的cDNA 片段；利用3'RACE 克隆扩增得到322 bp 的片段，利用5'RACE 克隆扩增得到417 bp 的片段；将序列拼接，得到一个具有1 173 bp 翻译区的完整CgFUT5基因序列，包括一个起始密码子 (ATG) 和一个终止密码子(TAA)、一个加尾信号 (AATAAA) 以及一段由34 个腺嘌呤核苷酸组成的poly(A) 结构 (图1)。

2.2 CgFUT5 基因序列分析

对CgFUT5基因序列推导出的氨基酸序列进行分析，序列由396 个氨基酸组成，经ExPASy-Compute pI-Mw tool 在线预测显示该蛋白相对分子质量为46.0 kD，理论等电点为9.65，属于碱性蛋白质。利用TMHMM 推算其跨膜结构域，结果显示，CgFUT5 具有一个跨膜结构域，由位于7—24 的18 个氨基酸组成 (图2)。

图2 CgFUT5 蛋白跨膜结构分析Fig.2 Transmembrane structure analysis of CgFUT5 protein

从NCBI 网站下载多个物种岩藻糖基转移酶蛋白质序列，构建CgFUT5基因进化树，结果显示，CgFUT5基因与秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans)FUT5(NC_003280.10)等具有合成Lewis 抗原功能的基因聚为一类 (图3)。

图3 FUTs 家族系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of FUTs family

2.3 CgFUT5 基因在太平洋牡蛎中的组织分布

通过RT-qPCR 分析了牡蛎5 种组织中的CgFUT5基因表达量，结果表明，CgFUT5基因在各组织中的表达量差异较大，以闭壳肌中的表达量为基准，在鳃、外套膜和唇瓣中的表达量分别为44、7 和3 倍，而消化腺中的表达量则很低 (图4)。

图4 CgFUT5 基因在太平洋牡蛎 5 种组织中的相对表达量注：不同字母代表组间极显著性差异 (P<0.01)。Fig.4 Relative expression of CgFUT5 gene in five tissues of C.gigasNote: Different letters represent extremely significant differences among the groups (P<0.01).

2.4 CgFUT5 重组蛋白的原核表达

使用SDS-PAGE 电泳分析经IPTG 诱导后的大肠杆菌总蛋白，结果显示，转化pET-CgFUT5 质粒的重组大肠杆菌总蛋白在46 kD 标准分子量大小处出现了蛋白条带，且阴性对照中无此条带，表明CgFUT5 蛋白在大肠杆菌表达系统中成功表达；而转化pET-His-Δ59-CgFUT5 质粒的大肠杆菌总蛋白在40 kD 标准分子量处出现了蛋白条带，表明截断部分N 端氨基酸序列的CgFUT5 蛋白也在大肠杆菌中成功表达，且表达量明显高于未截断序列质粒的蛋白 (图5)。

图5 CgFUT5 重组蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析Fig.5 Analysis of recombinant protein CgFUT5 by SDS-PAGE electrophoresis

2.5 CgFUT5 重组蛋白免疫印迹分析

使用鼠抗6×His 标签单克隆抗体 (图6) 和兔抗人FUT5 蛋白多克隆抗体 (图7) 的免疫印迹分析结果显示，在泳道2 中 (目的蛋白组) 有一个约为46.0 kD 的条带，而泳道1 中 (pET28a 空载对照组) 没有出现类似大小的条带。这一结果证实转化后的CgFUT5 蛋白成功表达并被转移至硝酸纤维素薄膜，且重组CgFUT5 蛋白具有与人FUT5 蛋白相似的免疫原性。

图6 以鼠抗 6×His 标签单克隆抗体为一抗分析CgFUT5 表达蛋白Fig.6 Expression of CgFUT5 protein analyzed by mouse anti-6×His labelled monoclonal antibody as primary antibody

图7 以兔抗人 FUT5 单克隆抗体为一抗分析CgFUT5 表达蛋白Fig.7 Expression protein of CgFUT5 analyzed by rabbit antihuman FUT5 monoclonal antibody as primary antibody

3 讨论

诺如病毒与牡蛎HBGAs 的相互作用及结合机制是目前研究的热点[9,11]，关于牡蛎组织血型抗原的合成方式和来源的研究尚处于起步阶段。通过类比人类HBGAs 的合成途径，可以假设牡蛎通过与人类相似的途径合成类HBGAs，因此逐一克隆牡蛎中的关键糖基转移酶基因是验证上述假设的必要手段。

在前期的研究中笔者团队已克隆了2 个太平洋牡蛎类HBGAs 合成相关的糖基转移酶基因[25,28]，其中牡蛎类FUT10基因与CgFUT5基因所预测的功能类似，但是二者在牡蛎中的组织分布规律却差异明显，类FUT10基因在消化腺组织中高表达而CgFUT5基因则几乎不表达，在鳃中类FUT10基因的表达量最低而CgFUT5基因却有极高的表达量。目前在人体中已经发现13 种岩藻糖基转移酶，其中FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10 和FUT11 均属于α-1,3/4-岩藻糖基转移酶，均具有合成Lewis 血型的功能[29-30]，部分岩藻糖基转移酶具有相同的底物特异性，但未见关于岩藻糖基转移酶的组织特异性报道，在其他哺乳动物中也未见报道。Kiem 等[31]在秀丽隐杆线虫α-1,3-岩藻糖基转移酶的研究中发现存在多种相同功能的岩藻糖基转移酶基因，其中的CEFT-1(Caenorhabditiselegansfucosyl transferases 1) 基因也只在特定的组织或细胞内表达，推测这种表达模式或许是秀丽隐杆线虫存在多种具有相似功能的岩藻糖基转移酶基因的原因。鉴于牡蛎与秀丽隐杆线虫同属于无脊椎动物，笔者推测太平洋牡蛎中同样具有多种功能相似且底物特异性不同的岩藻糖基转移酶基因，还进化出了复杂的组织特异性表达模式。有研究表明，不同基因型的诺如病毒在牡蛎中的富集具有组织特异性，如GI 型主要分布于牡蛎消化腺，GII 型主要分布于鳃和外套膜，而GIII 型均匀分布于牡蛎各组织中[32]。虽然诺如病毒疫情在我国未大规模暴发，但诺如病毒的区域性感染案例屡见不鲜，其中GII 型诺如病毒是引发我国诺如病毒感染的优势毒株[33-36]。牡蛎消化腺组织是目前研究诺如病毒特异性富集的主要靶点，但鳃作为牡蛎的滤食器官是牡蛎接触诺如病毒的第一道屏障，同样具有富集GII 型诺如病毒的特点。据此，提出了牡蛎CgFUT5基因在鳃中特异性表达并产生Lewis 抗原可能与牡蛎鳃组织特异性富集GII 型诺如病毒有关的假设。挖掘牡蛎类HBGAs 合成路径中的糖基转移酶基因，进一步了解牡蛎类HBGAs的合成机理，将能验证这一假设，从而为食源性诺如病毒疫情防控提供新的解决方案。

岩藻糖基转移酶广泛存在于多种动植物及细菌中，种类丰富且应用价值大，但目前成功表征的真核生物来源的岩藻糖基转移酶只有较少的一部分。真核岩藻糖基转移酶属于II 型跨膜蛋白，它们具有共同的结构域特征，即具有一个跨膜结构域，其侧翼是一个短的氨基端结构域和一个大的羧基端催化结构域[37]，这种特殊结构制约着岩藻糖基转移酶的异源表达与酶活表征。已有研究表明，跨膜结构域对糖基转移酶蛋白在原核或真核系统中的表达有直接影响，如可影响蛋白的可溶性、分泌性及表达量等[38-40]。母乳低聚糖的体外合成中所使用的糖基转移酶通常来自于细菌，这是因为细菌岩藻糖基转移酶不具有跨膜结构域，更容易进行大规模制备[41]。本文构建了截断跨膜域结构的CgFUT5基因原核表达质粒，证明截断后的质粒在大肠杆菌中实现了更高的表达量，不仅为CgFUT5 蛋白的提纯及功能验证奠定了基础，也可为牡蛎HBGAs 合成路径中的其他糖基转移酶基因的克隆表达研究提供参考。

4 结论

本研究主要对太平洋牡蛎FUT5基因进行了克隆，通过对CgFUT5 重组蛋白进行免疫印迹分析，证实其具有与人FUT5 蛋白相似的免疫原性，表明牡蛎中类HBGAs 的合成与人HBGAs 的合成路径具有相似之处，为进一步解析牡蛎特异性富集诺如病毒机理研究提供了新的证据。