南昌市动物园圈养动物3种肠道原虫的分子检测及基因型鉴定

梁玮珈，陈小庆

南昌市动物园圈养动物3种肠道原虫的分子检测及基因型鉴定

梁玮珈，陈小庆*

（江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045）

【目的】隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫是3种常见的寄生于人、家养动物和野生动物等肠道的寄生原虫，主要引起人和动物的腹泻。试验旨在调查南昌市动物园部分圈养动物3种原虫的感染情况并鉴定其基因型，为制订动物园人兽共患病传播防控措施提供参考依据。【方法】从南昌市动物园采集非人灵长类、偶蹄类、奇蹄类、象类、有袋类、鸟类和食肉类等圈养动物粪便样品共42份，提取粪样总DNA；采用PCR技术扩增隐孢子虫小亚单位核糖体RNA（SSU rRNA）、毕氏肠微孢子虫核糖体RNA内转录间隔区（ITS）和芽囊原虫SSU rRNA基因序列；并对阳性产物进行测序、序列比对及系统进化分析，确定3种肠道原虫的感染情况和基因型。【结果】42份粪便样本中有17份样品原虫为阳性，总检出率40.5%（17/42）；其中隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率分别为2.4%（1/42）、14.3%（6/42）和23.8%（10/42）。检出动物阳性占比分别为：非人灵长类64.7%（11/17）、偶蹄类23.5%（4/17）、奇蹄类5.9%（1/17）、有袋类5.9%（1/17）；且非人灵长类动物存在毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫混合感染。通过序列比对及系统进化分析，在矮马（奇蹄类）鉴定出1种隐孢子虫基因型（姬鼠基因型II），在长臂猿、金丝猴、博士猴、红尾长尾猴和羊驼中共鉴定到2种毕氏肠微孢子虫基因型（，）。在松鼠猴、黑白疣猴、博士猴、黑叶猴、金丝猴、羚羊和袋鼠中共鉴定到5种芽囊原虫基因型（、、、和）；其中芽囊原虫（、）和毕氏肠微孢子虫（、）均属人兽共患基因型。【结论】南昌市动物园圈养动物存在毕氏肠微孢子虫、芽囊原虫和隐孢子虫感染；从毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫中鉴定出人兽共患基因型，有潜在的人兽共患传播风险。动物园应进一步加强圈养动物肠道寄生原虫的监测，做好驱虫、消毒及预防人-兽传播等预防工作。

圈养动物；毕氏肠微孢子虫；芽囊原虫；隐孢子虫；分子检测；基因型

【研究意义】隐孢子虫（）、毕氏肠微孢子虫（）和芽囊原虫（）是3种常见的肠道寄生原虫。其属内种类复杂，具有广泛的宿主适应性，可以感染人类、哺乳类、爬行类、鸟类等多种动物[1-3]。宿主感染后主要出现腹痛、腹泻、呕吐等临床症状[1,3]，且可通过水源、食物、空气等进行传播，具有人兽共患风险。因此，调查动物园中圈养动物肠道原虫感染情况，对于有效监测和防控动物园圈养动物3种肠道原虫病具有重要的公共卫生学意义。【前人研究进展】隐孢子虫和毕氏肠微孢子虫基因型较多，具有人兽共患潜能，免疫力低下的儿童和老人更易感，症状相对较为严重[1,4]。目前已鉴定出240多种毕氏肠微孢子虫基因型，常见的人兽共患毕氏肠微孢子虫基因型主要有基因型、和等[5]；而隐孢子虫主要为人隐孢子虫（）、微小隐孢子虫（）、鼠隐孢子虫（）和火鸡隐孢子虫（）等基因型[6-7]。芽囊原虫也可感染人类和多种动物，引发感染性腹泻[8]。虽然一些研究表明在某些情况下芽囊原虫可能对宿主的肠道微生物多样性和健康产生积极影响，但它们也可以在某些情况下引发严重的疾病，特别是在免疫系统受损的人群中。芽囊原虫主要有和基因型[9]。此外，多项研究表明，这3种原虫在我国各地动物园圈养动物中有不同程度的流行。王利勤等[10]检测成都、碧峰峡和贵阳动物园圈养动物微孢子虫感染率为10.6%～34.5%，隐孢子虫感染率为0.51%～16.7%。贵阳某动物园芽囊原虫流行率为10.8%，鉴定出4个人兽共患亚型[11]；圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫感染率45.2%，有和两种毕氏肠微孢子虫基因型[12]。因此，动物园圈养动物可能是这3种肠道原虫的重要储存宿主，易造成水源污染和人兽共患原虫病的传播。【本研究切入点】上述3种原虫在南昌市动物园圈养动物中的流行情况及其基因型尚不清楚，有必要对其流行病学和分子特征进行调查分析，为制订动物园人兽共患病传播防控措施提供参考依据。【拟解决的关键问题】本研究采集42份圈养动物粪便样本，通过PCR扩增、测序及序列比对分析等方法对园内部分圈养动物肠道隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的感染情况进行分子流行病学调查。旨在为该动物园圈养动物肠道原虫的流行病学提供基础数据，为制订动物园人兽共患病传播防控措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 粪便样品

于2022年7月在南昌市动物园采集非人灵长类、偶蹄类、奇蹄类、象类、有袋类、鸟类和食肉类动物共42份粪便样本，置-20 ℃保存备用。动物均为圈养，由动物饲养员饲喂。

1.2 主要试剂与仪器

粪便DNA提取试剂盒，购自OMEGA公司；rDNA聚合酶、ExDNA聚合酶、dNTP Mixture、MgCl2、6×Loading Buffer、DL1000 DNA marker，均购自Takara公司；50×TAE，购自Solarbio公司；Nanodrop 2000核酸检测仪，购自Thermo Scientific公司；台式高速冷冻离心机，购自Eppendorf 公司；PCR仪和凝胶成像仪，均购自Bio-Rad公司。

1.3 DNA提取及引物合成

每份粪样取约200 mg于灭菌2 mL离心管中，严格按照粪便DNA提取试剂盒说明书提取粪便样品DNA；具体步骤为：将粪便样本用无菌去离子水（ddH2O）匀浆后用60目的金属过滤筛（孔径约为0.42 mm）过滤去除粪便中较大的杂质，加入SP1 Buffer和蛋白酶K裂解粪便中的细胞以释放DNA；经消化样本中的蛋白质后，分离DNA；再通过加入BL buffer和无水乙醇使DNA在溶液中沉淀出来，并通过HiBind DNA吸附柱收集DNA，最后用乙醇洗涤DNA沉淀，去除杂质和余留的溶液，静置吸附柱待乙醇完全挥发，用ddH2O洗脱DNA。所提取的粪便DNA采用Nanodrop 2000检测DNA质量和浓度，测得浓度≥50 ng/μL用于后续的PCR扩增，分装后置-20 ℃保存备用。参照文献[13-16]提供的引物序列合成隐孢子虫SSU rRNA、毕氏肠微孢子虫及芽囊原虫基因扩增引物。引物序列信息见表1，均由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.4 PCR扩增

以提取的粪便DNA为模板，采用巢式PCR方法扩增隐孢子虫和毕氏肠微孢子虫基因序列；常规PCR扩增芽囊原虫基因片段。3种原虫PCR扩增体系和程序具体如下：

隐孢子虫PCR反应体系（总体积为25 μL）：DNA模板2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，rDNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 14.875 μL。第一轮扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min；第二轮扩增程序除退火温度为58 ℃，其余条件同前[13,16]。毕氏肠微孢子虫PCR扩增体系（总体积为25 μL）：DNA模板1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×Exbuffer 2.5 μL，ExDNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 15.375 μL。两轮扩增程序均为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min[13-14]。芽囊原虫扩增总体积为25 μL，包括：DNA模板2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×Exbuffer 2.5 μL，ExDNA聚合酶0.25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 14.25 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸2 min[13,15]。1.2%的核酸凝胶电泳分析PCR扩增产物。

1.5 测序及序列分析

将阳性PCR产物送至擎科泽西生物技术有限公司进行测序；使用DNAStar 5.0分析原始序列，通过BLASTn在线程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）与GenBank数据库中已发表的序列进行比对；利用ClustalX 1.83软件进行多序列校对，以Mega7.0软件中最大似然法构建系统进化树，确定隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫及芽囊原虫的基因型。

表1 3种肠道原虫的PCR扩增引物

2 结果与分析

2.1 隐孢子虫SSU rRNA基因PCR结果及基因型鉴定

巢式PCR扩增结果显示：仅有1份矮马样品为阳性，经二轮PCR扩增出大小约830 bp片段，与预期大小相符（图1）。测序成功后经序列比对分析判定为隐孢子虫姬鼠基因型II（Csp.genotype II）（表2）。

1～5：粪便样品；+：阳性对照；-：阴性对照；M：DL1 000核酸质量标准。

2.2 毕氏肠微孢子虫ITS基因PCR扩增结果及基因型鉴定

巢式PCR扩增结果显示，二轮PCR成功扩增出6份阳性样品，其中包括长臂猿1份、金丝猴1份、博士猴1份、红尾长尾猴1份以及羊驼2份，PCR片段大小约390 bp，与预期大小相符（图2）。序列比对分析后鉴定出2种基因型，分别为（=4）和（=2）；系统进化分析表明均聚类于group 1（图3），为人兽共患基因亚型。

1～6：粪便样品；+：阳性对照；-：阴性对照；M：DL1 000核酸质量标准。

▲：南昌市动物园中鉴定的毕氏肠微孢子虫基因型和宿主。

2.3 芽囊原虫SSU rRNA基因PCR结果及基因型鉴定

PCR结果显示：共有10份采自松鼠猴（=1）、黑白疣猴（=1）、博士猴（=1）、黑叶猴（=1）、金丝猴（=3）、羚羊（=2）和袋鼠（=1）的粪便样品DNA成功扩增出目的条带，大小约600 bp，与预期大小相符（图4）。序列比对及系统进化分析鉴定到5种基因型，分别为：（=3），（=2），（=1），（=2），（=2）；其中和为人兽共患基因型（表2，图5）。

1～10：粪便样品；+：阳性对照；-：阴性对照；M：DL1 000核酸质量标准。

2.4 不同品种圈养动物感染率分析

结果表明：南昌市动物园中圈养动物总感染率为40.5%（17/42），其中隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫检出率分别为2.4%（1/42）、14.3%（6/42）和23.8%（10/42），且存在毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫混合感染的情况。其中非人灵长类共检测14份粪便样本，其中有11份样本检测到原虫感染，包括7个芽囊原虫阳性样本，经序列比对鉴定为（=2）、（=2）、（=1）和（=2），以及4个毕氏肠微孢子虫阳性样本，经序列鉴定为基因型（=4），其总阳性率为78.6%（11/14）；偶蹄类共检测14份粪便样本，其中有4份检测到原虫感染，包括2个芽囊原虫阳性，经鉴定为型以及2个毕氏肠微孢子虫阳性样本，经序列比对鉴定为型，其总阳性率为28.6%（4/14）；奇蹄类共检测4份粪便样品，只有1份检测到隐孢子虫感染，经序列比对鉴定为姬鼠基因型II，阳性率为25%（1/4）；有袋类共检测2份粪便样本，其中有1份样本检测到芽囊原虫阳性，经序列比对鉴定为型，其阳性率为50%（1/2）。在本研究中共检测到17份阳性，不同类别动物中检测阳性占比分别为：非人灵长类64.7%（11/17）、偶蹄类23.5%（4/17）、奇蹄类5.9%（1/17）、有袋类5.9%（1/17），其中非人灵长类的感染率显著高于其他动物（<0.05）。

◆：南昌市动物园中鉴定的芽囊原虫基因型和宿主。

3 结论与讨论

根据上述研究结果，南昌市动物园中的圈养动物普遍存在肠道原虫感染，总感染率为40.5%。本试验结果表明了圈养动物中肠道原虫感染的普遍性，可能成为人兽共患原虫病的潜在感染源，对动物及人类的健康造成极大威胁，同时也建议加强动物园圈养动物的健康管理和防控措施。不同类别的动物中感染率有显著的差异，非人灵长类的感染率最高，为64.7%。这可能与非人灵长类的生态习惯、社交行为、食物来源等有关。这些因素可能使非人灵长类更容易接触到感染源，增加感染的机会。相比之下，偶蹄类的感染率为23.5%，奇蹄类和有袋类的感染率均为5.9%。这些差异可能与动物的生态环境、饮食习惯、免疫系统等因素有关。针对不同动物类别，应该制定相应的预防和管理策略，以降低感染风险。

本研究表明南昌市动物园圈养动物毕氏肠微孢子虫的感染率为14.3%，低于郑州动物园（15.8%）[17]，高于北京动物园（7.3%）[18]的感染率；此结果提供了不同地区动物园中毕氏肠微孢子虫感染情况的比较，反映了不同地理环境和管理水平对于动物感染率的影响。值得注意的是，虽然南昌市动物园的感染率略高于北京动物园，但并不一定意味着南昌市动物园的动物健康状况更差。不同动物园的采样方法、样本量、动物种类、动物密度、饲养环境以及防控措施等都可能会对感染率产生影响。本项研究的另一个重要发现是，在非人灵长类动物中检测到了毕氏肠微孢子虫基因型，以及在羊驼中检测到基因型。这两种基因型都被认为是人畜共患基因型，意味着它们不仅可以感染动物，还可能对人类造成健康风险。此外，南昌市动物园中的圈养动物隐孢子虫的感染率为2.4%，高于郑州动物园（1.6%）[17]，低于贵阳动物园（15.5%）和西宁动物园（70%）[19-20]感染率；这些感染差异可能受到多种因素的影响，包括动物种类、饲养环境、采样方法、防控措施及地理位置、气候条件以及不同动物园的管理水平等。同时，在矮马中鉴定到了隐孢子虫姬鼠基因型II（sp. apodemus genotype II），表明在矮马中存在这种特定的隐孢子虫亚型。而南昌市动物园中的动物芽囊原虫的感染率为23.8%，明显低于秦岭动物园感染率（40.2%）[9]；说明国内不同动物园原虫流行程度存在差异。但在南昌市动物园中非人灵长类动物中芽囊原虫的感染率为64.7%，且存在芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫混合感染。既往研究已证实芽囊原虫是非人灵长类动物最易感的一种肠道寄生虫[21]；Petráová等[22]调查鲁邦多岛国家公园中黑猩猩、黑脸绿猴和黑白疣猴芽囊原虫感染率分别为71.4%、84.7%和83.7%。在我国多地也检测到非人灵长类动物芽囊原虫感染率较高，如秦岭地区平均感染率达75.6%，广州地区为16.7%～78.9%，西双版纳野生猴群检出率为40%[9,23-24]。根据南昌市动物园的研究以及既往研究，芽囊原虫感染在非人灵长类动物中普遍存在，且感染率相对较高。这表明芽囊原虫在这类动物中的传播较为广泛。同时，目前报道的非人灵长类动物易感基因型有10个，包括～、、、、和；其中、和是优势基因型[25-26]。本研究也检测到、、和基因型，与国内外报道的研究结果基本一致[27-29]。此外，Yoshikawa等[25]认为基因型在恒河猴和人之间可能存在相互感染；珀斯动物园非人灵长类动物中分离出和基因型，其中型与饲养员分离株相似[30]；格但斯克动物园非人灵长类动物感染、、和基因型，饲养员感染和基因型，人和猴序列相同[29]；以上结果均表明动物可能是人芽囊原虫病的重要感染源，存在直接传播的可能性。

表2 南昌市动物园不同圈养动物3种肠道原虫感染情况及基因型

以上发现表明圈养动物中肠道原虫感染具有广泛性和严重性。不同类别动物的感染率差异可能与生态习惯、饮食、社交行为等因素有关。研究还检测到了多个人兽共患基因型的肠道原虫，说明其多样性和潜在的人兽共患感染风险。提示园内动物，包括金丝猴、黑白疣猴、长臂猿、袋鼠等为主要的原虫储存宿主，有潜在传播人兽共患病原风险。鉴于3种肠道原虫主要通过污染的水源和食物传播，建议动物园进一步加强动物饲养管理，逐步改善动物的生活环境，确保饲养用水和食物的清洁；按时清理动物粪便和消毒圈舍，避免动物之间的相互传播；定期监测饲养动物寄生虫感染，制定合理的驱虫方案，以控制园内寄生虫病的流行及降低其人兽共患风险。总之，本研究为进一步开展圈养动物肠道原虫流行病学调查奠定了基础，也为南昌市动物园的饲养管理措施优化及饲养员和游客的健康防护提供了参考依据；对保护动物及公共卫生安全均有重要意义。

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Molecular Detection and Genotyping of Three Enteric Protozoa in Captive Animals from Nanchang Zoo

LIANG Weijia, CHEN Xiaoqing*

（School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

,andsp. are three common parasites, which inhabit in the intestines of humans, domestic animals, and wildlife, primarily causing diarrhea in human and animals. This experiment aimed to investigate the epidemiological status and identify their genotypes of three parasites among captive animals in Nanchang Zoo, and provide references for the prevention and treatment of intestinal parasitic diseases in wild animals.A total of 42 fecal samples were collected from captive animals including non-human primates, ungulates, perissodactyls, elephants, marsupials, birds, and carnivores in Nanchang Zoo. Total DNA was extracted from the fecal samples, and a PCR assay was employed to amplify the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene of, the internal transcribed spacer (ITS) region of, and the SSU rRNA gene ofsp.. Positive amplicons were sequenced, aligned, and subjected to phylogenetic analysis to determine the infection status and genotypes/subtypes of these three intestinal parasites.The results indicated that 17 out of 42 fecal samples were positive by PCR, with a total infection rate of 40.5% (17/42). The infection rates of,, andsp.were 2.4% (1/42), 14.3% (6/42), and 23.8% (10/42), respectively. Among the detected animals, the positivity rates were as follows: non-human primates 64.7% (11/17), ungulates 23.5% (4/17), perissodactyls 5.9% (1/17), and marsupials 5.9% (1/17). Furthermore, mixed infections ofandsp. were observed in non-human primates. Through sequence alignment and phylogenetic analysis, onegenotype (sp. apodemus genotype II) was identified in ponies, and twogenotypes (,) were identified in gibbons, golden snub-nosed monkeys, rhesus monkeys, red-tailed langurs, and alpacas. Fivesp. subtypes (,,,, and) were identified in squirrel monkeys, black-and-white colobus monkeys, rhesus monkeys, black leaf monkeys, golden snub-nosed monkeys, antelopes, and kangaroos. Notably, the genotypes,,, andare known as zoonotic genotypes.Captive animals in Nanchang Zoo were infected with,andsp.. The zoonotic genotypes are identified fromandsp., which have a potential transmission risk. This underscores the need for enhanced monitoring of intestinal protozoa in captive animals, and the implementation of deworming, disinfection, and preventive measures against zoonotic transmission within the zoo setting.

captive animal;;sp.;spp.; molecular detection; genotype

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.71

S852.61+1

A

2095-3704（2023）04-0469-09

2023-09-26

2023-11-06

国家自然科学基金项目（32202839）和江西省教育厅科技创新项目（GJJ180185）

梁玮珈（2002—），女，主要从事动物寄生虫学研究，2283078323@qq.com；*通信作者：陈小庆，讲师，博士，chenxiaoqing2013jl@163.com。

梁玮珈，陈小庆.南昌市动物园圈养动物3种肠道原虫的分子检测及基因型鉴定[J]. 生物灾害科学, 2023, 46(4): 469-477.