不同生物填料构建零换水凡纳滨对虾养殖系统研究

袁光年,徐爱玲,刘勇新,丁 宁,周 涛,宋志文

(青岛理工大学 环境与市政工程学院,青岛 266525)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又称南美白对虾,是世界三大高产量对虾养殖品种之一。随着养殖规模不断的扩大,传统换水养殖模式使水域环境污染问题日益严重,水质恶化会诱发虾病暴发,并阻碍对虾养殖业的发展。为了实现水产养殖可持续发展,众多学者对零换水技术(Zero Water Discharge,ZWD)进行了研究,目前国内主要研究的零换水养殖系统有工厂化循环水养殖系统和生物絮团系统[1-2]。工厂化循环水养殖系统中对虾产量高,水环境可控,但是设备投资成本高,运行费用昂贵;而原位处理的生物絮团系统可调控水质、减少换水、减少疾病爆发、提高饲料利用率,但是操作难度大,且无法较好地控制亚硝氮的增长,此外投加大量碳源会增加额外养殖成本。

相比生物絮团系统,人工基质-生物膜是一种低碳、清洁的养殖水体原位修复技术,具有提高凡纳滨对虾存活率、增强免疫力和净化水质等优点[3]。聚氨酯海绵具有孔隙率高、比表面积大和吸附力强等特点,在工业废水中氨氮和亚硝酸盐氮去除率为90.1%和89.3%[4-5]。丝瓜络具有天然纤维网状结构,可为微生物提供更多的附着点,研究表明丝瓜络挂膜填料对生活污水氨氮和总氮的去除率可达到90%和78%[6-7]。聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯环都具有较好的机械强度以及抗冲刷能力等优点[8-9],王光玉等[10]研究了不同大小PVA球对氨氮的去除率,结果表明PVA小球和PVA大球在18和22 min时对氨氮去除速率为58和48 g/ (m3·d);章霞等[11]研究了聚乙烯环挂膜填料对氨氮去除效果,研究表明聚乙烯环填料42 h氨氮去除率为90.8%。适宜的人工基质对发挥稳定、持续的水体净化作用有积极影响,研究不同填料生物膜的微生物群落结构组成、功能具有重要意义。

本实验以预挂膜聚氨酯海绵、聚乙烯环、PVA球和丝瓜络作为生物膜基质,将其内置凡纳滨对虾养殖系统,比较分析不同养殖系统水质变化、对虾生长状况与生物膜细菌群落结构组成,以期为人工基质-生物膜养殖系统生物载体的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 生物填料生物膜培养方法

1.2 实验装置和养殖管理办法

8个养殖池(有效容积100 L/个)分为4个实验组,按2%体积比将各填料放入养殖池中。实验海水由人工海水素配制而成,盐度15‰。凡纳滨对虾P5虾苗购于广东湛江某虾苗厂,每个养殖池放入64尾(相当于养殖密度:800 ind/m3)。饲料购自澳华饲料有限公司,每日投喂量按照对虾体重4%～10%,每日分3次投喂,时间分别为9:00,14:00,20:00。实验后期采用碳酸氢钠调节养殖水体pH。整个养殖期间不换水,定期补充蒸发水量和排污,排污周期为1周进行1次,每次排污损失水量低于总体水量的5%。每周对KA和JA填料进行清洗,整个实验持续76 d。

表1 4种填料物理性质与生物膜硝化性能

1.3 高通量测序方法

实验第50天各实验组水质指标基本稳定,从养殖系统取填料样品,按照土壤DNA提取试剂盒(OMEGA)操作步骤对样品DNA进行提取,采用P360超微分光光度计(IMPLEN公司,德国)检测总DNA浓度与纯度,将符合扩增要求DNA样品送至上海美吉生物有限公司进行16S rRNA基因高通量测序。通过拼接、指控、去接头等获得优化序列,将优化序列以97%相似度进行OTU聚类,通过生信云平台进行Shannon,Simpson,Ace和Chao指数分析,采用RDP classlfler贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析。

1.4 水质分析方法

1.5 凡纳滨对虾生长状况

实验结束后记录凡纳滨对虾体重、存活率、特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)。计算公式如下:

FCR=F/(W1-W0)

Sr=(N1/N0)×100

SGR=[(lnW1-lnW0)/t1]×100

式中:FCR为饲料系数(FCR);Sr为存活率,%;SGR为特定生长率(SGR),%;N1,N0分别为终末存活数和初始投放数;t1为养殖76 d;F为总投喂量,g;W1,W0分别为终末平均体重和初始平均体重,g。

1.6 数据分析和处理

采用Excel和Origin 2018软件进行数据处理,数据用平均值及标准差(means±SD)表示。使用ANOVA方差分析,P<0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 养殖系统水质情况

养殖过程中凡纳滨对虾养殖系统水质指标情况见表2。由表2可知,不同实验组温度、盐度、pH和溶解氧无显著差异,均满足凡纳滨对虾生长要求;SA实验组浊度最高,其次为PA,与KA和JA实验组存在显著差异。

表2 水质参数

2.2 养殖过程中TAN浓度变化情况

各实验组中TAN浓度变化情况如图1所示。由图1可以看出,养殖过程中,在5～76 d各实验组TAN浓度均表现出先缓慢升高最后降低的趋势。实验组JA和KA在0～10 d出现浓度峰值,分别为(1.66±0.61)和(2.18±0.94) mg/L,之后迅速下降。各实验组在60～76 d内出现TAN浓度峰值,各实验组JA,KA,SA和PA的峰值分别为(3.64±0.77),(3.72±0.03),(6.89±0.52)和(2.75±0.42) mg/L。

2.3 养殖过程中浓度变化情况

2.4 养殖过程中浓度变化情况

2.5 凡纳滨对虾生长状况

实验过程中凡纳滨对虾生长情况见表3。各实验组对虾均重和存活率分别为8.19～8.49 g和61.7%～68.8%,JA组和SA组对虾均重显著高于KA组和PA组(P<0.05),KA组SGR和FCR上与其他实验组有显著性差异(P<0.05)。

2.6 生物膜细菌群落结构与多样性分析

2.6.1 细菌Alpha多样性分析

各实验组生物膜细菌Alpha多样性分析结果见表4。由表4可知,各实验组有效OTUs为490～564,测序覆盖率在99.7%～99.8%,测序覆盖率说明测序结果能较好地展现各填料生物膜微生物群落组成:JA组具有最高的微生物丰富度和群落多样性;KA组的多样性指数最低;SA组的丰富度指数最低。

表3 凡纳滨对虾生长状况

表4 填料表面细菌群落Alpha多样性指数

2.6.2 细菌群落结构组成分析

各样品中相对丰度大于0.01%的菌门有16个(图4(a)),优势菌门主要包括变形菌门(Proteobacteria,35.45%～56.54%)、浮霉菌门(Planctomycetota,5.12%～38.14%)、拟杆菌门(Bacteroidota,8.24%～15.29%)和绿弯菌门(Chloroflexi,2.87%～15.57%),其中JA,SA和PA组中变形菌门为第一优势菌门,相对丰度分别为44.99%,46.47%和56.54%;JA和PA组中拟杆菌门为第二优势菌门,相对丰度分别为15.29%,12.29%,SA组中绿弯菌门(15.37%)为第二优势菌门,KA组中浮霉菌门的相对丰度超过变形菌门,分别为38.14%和35.45%。

总共检测出菌属353个,对相对丰度大于1%的属水平进行分析(图4(b))。JA组中的优势菌属有norank_c_OM190(9.33%),norank_f__A4b(5.18%)和Simiduia属(3.96%);KA生物膜中的优势菌属有unclassified_p__Planctomycetota(21.61%),norank_f__A4b(13.77%)和norank_c_OM190(9.33%);SA组中优势菌属有norank_f__A4b(15.80%)、噬甲基菌属(Methylophaga,7.24%)和norank_f__Balneolaceae(5.79%);PA组中优势菌属有鲁杰氏菌属(Ruegeria,16.98%)、Simiduia属(6.31%)和SM1A02(5.27%)。

养殖阶段具有硝化和反硝化功能的细菌属分布结果见表5。由表5可知,硝化细菌包括氨氧化细菌、氨氧化古菌和亚硝酸氧化细菌。与氨氧化功能相关的有亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和unclassified_Nitrosomonadaceae,与亚硝酸氧化功能相关的有硝化螺旋菌属(Nitrospira)。JA,KA,SA和PA氨氧化细菌相对丰度分别为1.98%,2.34%,0.40%和1.30%。亚硝酸氧化细菌相对丰度远低于氨氧化细菌。与反硝化相关的有假单胞菌属(Pseudomona)、固氮弧菌属(Azoarcus)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)和鲁杰氏菌属(Ruegeria)。假单胞菌属、生丝微菌属和鲁杰氏菌属为JA的优势属,生丝微菌属和鲁杰氏菌属为KA的优势属,固氮弧菌属和鲁杰氏菌属分别为SA和PA的优势属。

图4 细菌群落结构组成

表5 填料表面硝化细菌和反硝化细菌菌属丰度水平

3 讨论

3.1 不同挂膜填料对凡纳滨对虾养殖水质的影响

不同挂膜填料对水质调控效果有所不同。悬浮颗粒物增加会影响凡纳滨对虾的进食功能,导致虾的死亡。本实验中聚氨酯海绵填料的浊度均值最低,说明其吸附性最强,而丝瓜络填料浊度均值最高,原因是丝瓜络填料主要由半纤维素、α-纤维素、木质素组成,组成成分容易被细菌分解[12],部分分解残渣使水体中悬浮颗粒物进一步增多,而丝瓜络填料分解未对对虾存活率造成影响,推测原因可能是丝瓜络填料悬浮颗粒物浓度未超过凡纳滨对虾养殖的安全值[13]。

3.2 不同挂膜填料对凡纳滨对虾生长状况的影响

LEZAMA-CERVANTES等[21]研究了聚氨酯生物垫对凡纳滨对虾养殖系统的影响,研究结果表明聚氨酯海绵垫对悬浮颗粒物和微生物的吸附作用,为对虾提供了额外的食物来源。WILÉN等[22]认为碳源的增加使异养菌具有更高的菌体蛋白含量。本实验中聚氨酯海绵和丝瓜络实验组对虾均重明显高于聚乙烯环和PVA球实验组,由此说明聚氨酯海绵填料能够吸附、降解和利用的有机物和无机物更多,聚氨酯海绵填料生物膜的生物量也就更大。而丝瓜络填料因为释放更多的有机碳源,导致异养菌数量增加,同时悬浮颗粒物增多,因此生物量也随之增大,凡纳滨对虾通过对生物膜或者悬浮物进行滤食后自身重量有所提高。

3.3 不同挂膜填料对生物膜细菌群落结构的影响

填料表面微生物丰富度和群落多样性越高说明群落稳定性越强。聚氨酯海绵和PVA球填料生物膜Ace,Chao和Shannon指数高于聚乙烯环和丝瓜络填料。细菌群落丰富度和多样性指数越高,水质净化功能也更好,与裘钱玲琳等[23]研究结果相印证。聚氨酯海绵具有较好的生物再生性,在好氧环境中生物膜更容易生长,聚氨酯的多孔结构决定该填料细菌群落结构具有更高的多样性[24]。

变形菌门是水产养殖中最为常见的优势菌门,变形菌门广泛分布于海洋环境中,并且能够参与高分子有机物的分解,有研究认为健康的对虾生长环境中变形菌门和拟杆菌门为主要优势菌门[25-27],与本实验中PVA球和聚氨酯海绵填料的研究结果相符。拟杆菌门可对纤维素进行降解[28],该门类菌群可对硝酸盐进行同化作用[29];有研究表明浮霉菌门在对虾养殖系统中为第二优势菌门[30]。魏亚茹等[31]研究认为浮霉菌门的厌氧氨氧化菌群为生态友好型脱氮微生物。有研究表明在对虾发病前绿弯菌门相对丰度有所升高[32]。在属水平上,norank_f__A4b来自绿弯菌门中的厌氧绳菌纲,该菌纲为一类丝状菌纲[33]。norank_c_OM190来自浮霉菌门,研究认为norank_c_OM190对氨氮和硝态氮可能具有自养氨氧化和反硝化作用[28];研究表明Simiduia属对弧菌具有抑制作用[34],而实验中所测各实验组中的弧菌群落相对丰度很低(<0.05%)。

4 结论

高通量测序结果表明,聚氨酯海绵、PVA球和丝瓜络实验组中变形菌门为第一优势菌门,聚氨酯海绵、PVA球中拟杆菌门为第二优势菌门,丝瓜络实验组中绿弯菌门为第二优势菌门;聚乙烯环实验组中浮霉菌门和变形菌门为优势菌门。PVA球和聚氨酯海绵实验组生物膜的细菌丰富度和多样性指数均高于丝瓜络和聚乙烯环实验组,与水质净化效果相对应。实验组中亚硝酸氧化细菌相对丰度远低于氨氧化细菌,硝化作用优势菌属均为亚硝化单胞菌属。