甘蔗渣多酚的超声辅助提取工艺优化研究

张展鹏,慎 璐,李 灿*

齐鲁工业大学(山东省科学院) a.基辅学院;b.生物工程学院,山东 济南 250353

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)属于禾本科(Poaceae),喜湿热,喜光,在热带、亚热带以及温带地区均有分布,是重要的糖料原产品和全世界第二大生物能源作物[1-3],我国广西贵族自治区的甘蔗种植面积居国内之首,占全国六成以上[4]。甘蔗是我国重要的经济作物,生产数量在世界范围内可以排进前三[5]。近年来,国内外许多学者对甘蔗多酚研究的数据显示,甘蔗多酚具有良好的抗氧化、抑制血糖、降低血脂、抑菌、抗肿瘤等功效[6-8]。侯小涛等[9]对甘蔗多酚进行了体外抗菌实验,研究结果发现,甘蔗多酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌都有着一定的抑制作用,这为甘蔗多酚的抑菌药用价值提供了基础。廖泽勇[10]运用MTT法检测后,计算甘蔗叶黄酮类物质对肿瘤细胞的生长抑制率,实验显示叶黄酮类物质对六种肿瘤细胞均有一定的抑制作用,其中对Hela和Caco-2肿瘤细胞的抑制效果尤为明显。

传统工艺大多使用有机溶剂进行提取,但是有机溶剂的消耗量大,提取工艺成本高,对环境也会造成危害[11-13]。超声辅助提取技术作为一种新型的提取方法,基本原理是利用超声波在提取液中引起的空化现象,加速提取物中目标成分的释放和转移[14-15]。相比于传统的提取方法,超声辅助提取多酚技术具有操作简便、提取效率高、提取时间短、产品质量好等优点[16]。本文利用单因素试验与响应面法结合,研究超声波技术辅助甘蔗多酚的提取,旨在优化甘蔗多酚提取工艺,提高多酚的提取率和纯度。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

甘蔗渣(烘干粉碎备用);无水乙醇;植物总酚(TP)含量检测试剂盒(索莱宝生化试剂盒事业部);酶标仪(BioTek Instruments,Inc.);数显恒温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司);微型离心机(美国Andy Bio公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的绘制

使用植物总酚(TP)含量检测试剂盒进行没食子酸的标准曲线绘制。(标准品5 mg没食子酸、试剂一Folin-Ciocalteu试剂、试剂二Na2CO3溶液)

取不同质量浓度的没食子酸标准溶液(0.625、0.156、0.078、0.039、0.020 mg·mL-1)50 μL,依次加入250 μL试剂一,涡旋混匀2 min后,各加入250 μL试剂二和450 μL蒸馏水,涡旋混匀后静置10 min,于760 nm处测定吸光度。建立标准曲线,如图1所示,求得回归方程y=3.946 2x+0.008 4,R2=0.995 6。

1.2.2 甘蔗多酚提取量的测定

甘蔗渣样品烘干称重,粉碎,过50目筛(微孔直径280 μm),称取1 g,加入适量乙醇溶液,使用超声细胞粉碎机进行辅助提取,一段时间后,离心取上清液待测。根据测没食子酸标准曲线得回归方程,计算样本质量浓度y(mg·mL-1),最终得到甘蔗多酚的质量分数。

多酚质量分数=y×提取液体积÷样本质量。

1.2.3 单因素试验

取30 g经粉碎过50目筛(微孔直径280 μm)的甘蔗粉末,选择合适的液料比,加入一定浓度的乙醇溶液,在特定的水浴温度和超声功率下,对其进行一定时间的超声辅助提取。提取结束后放入离心机12 000 r/min,25 ℃,离心10 min,取上清液,待测。探究不同的乙醇体积分数(35%、45%、55%、65%、75%)、不同的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、不同超声时间(15、25、35、45、55、65 min)、不同水浴温度(30、40、50、60、70 ℃)和不同超声功率(75、85、95、105、115 W)对甘蔗多酚提取量的影响,其中将各因素初始水平固定为乙醇体积分数45%、液料比10∶1 (mL·g-1)、水浴温度45 ℃、超声时间25 min、超声功率95 W。

1.2.4 响应面试验

根据各个单因素试验对甘蔗多酚产量的不同影响,使用Design-Expert13软件,响应面Box-Benhnken试验设计原理设计四因素三水平共29组响应面对实验进行分析,从而得到甘蔗多酚提取的最佳工艺。响应面分析因素表如表1所示。

表1 Box-Benhnken试验设计表

2 结果与分析

2.1 影响甘蔗多酚提取的单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

水浴温度固定45 ℃,液料比10∶1(mL·g-1),在95 W的超声功率下,将乙醇体积分数作为单变量,分别取值35%、45%、55%、65%、75%,提取25 min。结果如图2所示。

随着乙醇体积分数的增加,甘蔗多酚提取量先增加后减少。在乙醇体积分数55%时甘蔗多酚提取量最高,为8.12 mg·g-1;乙醇体积分数为35%时甘蔗多酚提取量最低,为6.37 mg·g-1。乙醇作为溶剂可以有效的溶解多酚类的化合物。在低浓度下,乙醇体积分数越高,甘蔗多酚的萃取效率越高,但在一定浓度以上,乙醇的萃取效率受到其他因素的制约,如乙醇分子的空间排列和分布密度等,甘蔗多酚的萃取效率随着乙醇体积分数的增加而逐渐降低[17]。因此,提取甘蔗多酚工艺的最佳乙醇体积分数为55%。

图2 乙醇体积分数对甘蔗多酚提取的影响

2.1.2 液料比对多酚提取量的影响

水浴温度固定45 ℃,乙醇体积分数55%,在95 W的超声功率下,将液料比作为单因素变量,分别在10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL·g-1)的条件下,提取25 min,结果如图3所示。

当液料比低于15∶1(mL·g-1)时,随着提取液的增多,甘蔗多酚的提取率大幅度提高,在液料比数值较低时,其变化对甘蔗多酚的提取率影响较大。较低的液料比下,甘蔗粉末不能充分地与提取液接触混匀,减少了甘蔗多酚的溶出,合适的液料比可以促进多酚的转移和溶解,从而增加多酚的提取量。然而,过高的液料比会增加溶剂的使用,对产品的分离纯化造成影响,有机溶剂的残留使多酚应用受限,也会导致成本过高。液料比超过15∶1(mL·g-1)后,甘蔗多酚的提取率开始逐渐下降,当液料比到达25∶1(mL·g-1)后,对于甘蔗多酚的提取率影响十分微弱。因此,甘蔗多酚最佳提取液料比为15∶1(mL·g-1)。

图3 液料比对甘蔗多酚提取的影响

2.1.3 超声时间对多酚提取量的影响

水浴温度固定45 ℃,乙醇体积分数55%,液料比为15∶1(mL·g-1),在95 W的超声功率下,将超声时间作为单因素变量,分别超声15、25、35、45、55、65 min,进行提取,结果如图4所示。

从超声时间15 min开始,甘蔗多酚的提取量逐步增加,一直到35 min时达到峰值为7.05 mg·g-1,适当的超声时间可以增加多酚与溶剂之间的物质传递速率,促进多酚的提取。而后随着时间的增加,甘蔗多酚的提取量开始下降,在65 min时最低为4.74 mg·g-1。在35 min时甘蔗多酚的提取已经达到饱和,继续进行超声,超声波能量的累积和吸收会引起提取液中温度的升高、压力的变化等多种复杂作用,对甘蔗多酚的稳定性产生影响,致使甘蔗多酚降解。过长的时间也会导致甘蔗多酚的氧化,最终产量有所损失。这些因素相互作用造成甘蔗多酚提取量的变化,在使用超声波技术辅助提取时,选取超声时间要考虑多酚的稳定性,避免过度超声造成不利影响。因此,甘蔗多酚提取工艺的最佳提取时间为35 min。

图4 时间对甘蔗多酚提取的影响

2.1.4 水浴温度对甘蔗多酚提取的影响

乙醇体积分数55%,液料比15∶1(mL·g-1),在95 W的超声功率下,将水浴温度作为单因素变量,分别在30、40、50、60、70 ℃的温度下,提取35 min,结果如图5所示。

随着温度的升高,甘蔗多酚的提取量增加明显。因为温度的升高可以促进乙醇分子与甘蔗中多酚分子之间的相互作用,从而提高多酚分子的溶解度和渗透性,有利于多酚的溶解和扩散[18]。在50 ℃时,提取量达到了最大值为10.84 mg·g-1。但是在超过50 ℃之后,温度提高,多酚的提取率却开始下降,降低幅度相较于之前上升幅度显著减小,在长时间的高温下,多酚受热发生反应生成其他物质[19]。因此,甘蔗多酚提取工艺的最佳提取温度为50 ℃。

2.1.5 超声功率对多酚提取量的影响

水浴温度50 ℃,乙醇体积分数55%,液料比15∶1(mL·g-1),将超声功率作为单因素变量,分别在75、85、95、105、115 W的功率下,提取35 min,结果如图6所示。

甘蔗多酚的提取量随着超声功率的增大而增多,在105 W处达到最高点,多酚提取量为17.35 mg·g-1,继续增大超声功率,多酚提取量开始下降。超声波作用可以引起植物细胞壁的物理破碎,释放多酚类化合物。同时细胞液内部会产生剧烈的液流和振动,增加了料液间的质量传递,促进了甘蔗多酚的溶解和扩散,在空化作用下甘蔗多酚更快的进入溶剂[20-21],导致甘蔗多酚的提取量增加。但是当超声功率过大时,反而会对物质产生破坏[22-23],影响甘蔗多酚的提取效率。超声功率的选择应根据具体的提取物质、设备性能和工艺要求进行优化和调整。过低的功率可能导致提取效果不理想,而过高的功率可能导致不良反应或能源浪费。在实际操作中,需要进行实验,确定最佳的超声功率条件以实现最佳的多酚提取效果。因此,甘蔗多酚提取工艺的最佳超声功率为105 W。

图6 超声功率对甘蔗多酚提取的影响

2.2 响应面优化

2.2.1 正交试验结果分析

表2为29组试验的结果,对数据进行分析整理,得回归模型方程为:Y=17.88+0.809 0A-3.17B+0.300 9C-0.197 3D-0.858 3AB+0.458 7AC+0.014 8AD+0.429 1BC+0.269 1BD+0.222 0CD-5.78A2-1.88B2-3.31C2-2.27D2

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 方差分析

表3(续)

图7所示为使用Design-Expert软件,通过对上述回归方程模型进行分析,所得的各个因素交互影响甘蔗多酚产量的三维响应面图。在响应面的分析中,曲面坡度和等高线是两个非常重要的指标,用于反映因素的影响程度和交互作用的强度。曲面坡度是指响应面模型的曲率程度,即响应变量在不同因素取值下的敏感程度。如果曲面坡度越陡峭,说明响应变量对该因素的变化越敏感,该因素对响应变量的影响越大。相反,如果曲面坡度越平缓,则说明该因素对响应变量的影响越小。等高线则用于反映两个因素之间的交互作用程度。如果等高线呈椭圆形且曲线密集,则表明两个因素之间的交互作用对响应变量的影响显著。反之,如果等高线呈圆形且曲线稀疏,则说明两个因素之间的交互作用对响应变量的影响不显著。如图7所示,交互项CD(水浴温度与超声功率)的等高线近似于圆形,交互项BC(液料比与温度)和交互项BD(液料比与超声功率)的响应面坡度较缓,说明其响应量变化较小,交互作用均不显著,这与上述方差分析的结果一致。

2.2.2 响应面优化最佳工艺验证

使用响应面软件对甘蔗多酚提取工艺的最佳条件进行预测,得最适条件为乙醇体积分数58.215 8%、液料比10.853 9∶1(mL·g-1)、水浴温度49.334 ℃、超声功率103.075 W。在此条件之下,甘蔗多酚提取量理想值为19.097 4 mg·g-1。将预测数据可行化,即乙醇体积分数58%、液料比11∶1(mL·g-1)、水浴温度49 ℃、超声功率103 W,在此条件下做三次平行试验,进行验证,得到甘蔗多酚提取质量的平均值为18.87 mg·g-1,与预测值接近,表明该响应面模型真实、准确、有效。

3 结 论

我国的甘蔗资源充足,价格低廉,甘蔗渣作为甘蔗加工过程中的副产品,鲜有科研人员进行研究。现有的研究结果表明,甘蔗多酚在调节免疫和控制血糖方面具有良好功效,值得进一步开发利用。在本研究中,经单因素试验和响应面设计,使甘蔗多酚的提取工艺得到优化,影响甘蔗多酚提取量的4种主要因素影响力由大到小分别为:液料比(B)、乙醇体积分数(A)、水浴温度(C)、超声功率(D)。优化后的方案为乙醇体积分数58%、液料比11∶1(mL·g-1)、水浴温度49 ℃、超声功率103 W,超声时间35 min,测得甘蔗多酚产量18.87 mg·g-1。相比较于传统提取方法,该方法提取效率高,显著地缩短了提取周期,并且操作简单,易实现大规模生产,为甘蔗多酚的提取提供了依据。

根据报道显示,不同品种甘蔗的甘蔗多酚存在差异,个别品种的甘蔗多酚产量要明显高于其他。导致这种差异的因素有很多,例如甘蔗生长环境的不同,基因品种不同,生长时间不同等。因此需要更多的研究来确定这些因素对甘蔗多酚质量分数的影响,并开发出适当的种植和加工方法来提高甘蔗多酚的含量,有助于降低成本,提高生产效率,从而促进相关产业的发展。