硫酸盐还原菌WH16-1 对烟草吸收镉的影响

周高婷，杜剑波

1.上海纪凯科技服务有限公司，上海 212000；2.上海完形健康管理咨询有限公司，上海 212000

目前，土壤重金属污染广泛存在。我国土壤的重金属总超标率为16.1%，其中土壤镉超标率达7%[1]。土壤中镉存在形式的不同会影响其植物有效性，植物有效性从大到小的顺序依次为交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态和残渣态。施用无机矿物蒙脱石可以降低土壤中镉的生物有效性，促进水稻生长[1]。施用硫酸盐还原菌WH16-1 也可以降低土壤中镉的生物有效性，从而增加水稻产量、减少水稻中镉的含量[2]。

烟草是一种重要的经济作物，烟叶中镉的含量严重影响着烟草的品质。烟叶中镉的含量与土壤中镉的含量密切相关，我国烟叶主产区中烟叶的镉含量远超过食品中的允许值——0.2 mg/kg[3]。本文利用土壤盆栽和大田实验探究了细菌WH16-1 对烟草产量、叶绿素和酶活的变化及烟草根茎叶中镉含量的影响，验证了其对镉污染土壤的修复效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用菌株为WH16-1。细菌培养参照文献[2]在LB 培养基中进行。烟草品种为云烟-87，由湖北省烟草公司恩施州公司提供。烟草幼苗于实验开始前30 d 左右播种培育，待幼苗长到15 cm 左右，选择健康、长势均一的烟苗进行实验。

1.2 烟草盆栽实验

采用恩施市望城坡农田土，土壤自然风干，去除大块石头及杂草。在每个盆中装入15 kg 风干土壤，在盆底部垫上盆垫。按15 %含水率加水，并在每个盆中装入数量相同、大小均一的小石头，以便透气。实验设6 个处理，分别是：对照S（不加镉和菌）、对照S+2Cd（加2 mg/kg Cd2+不加菌）、对照S+6Cd（加6 mg/kg Cd2+不加菌）、实验组S+WH16-1（不加Cd2+加菌）、实验组S+2Cd+WH16-1（加2 mg/kg Cd2+加菌）、实验组S+6Cd+WH16-1（加6 mg/kg Cd2+加菌）。每种处理选取6 盆，共计36 盆。按照烟草盆栽实验设计，分别加入硝酸镉溶液或等量的去离子水对土壤进行处理，边拌入镉溶液边搅拌土壤，使其混合均匀。采用深施覆土的方式按40 g/盆添加复合肥（复合肥N2O∶P2O5∶K2O =10∶10∶20）并拌匀。1 d后，加菌处理组加入500 mL/盆菌液，不加菌液的处理组加入等量0.9%氯化钠溶液；3 d 后，在每盆土壤的相同深度处种植一株健康状况、大小、叶片个数基本相同的云烟-87 烟苗。在盆栽过程中要保证土壤具有一定的湿度，定期补充水分并松土。按照烟草的正常生长条件进行管理。在烟草成熟期（120 d）取烟草样品，同时取盆中距离地表15 cm 左右的烟草根际附近的土样，土样经风干研磨后过孔径为0.25 mm 筛，植物样品按照烟草常用的工艺进行杀青、烘干，及至含水率低于5 %。

1.3 烟草大田实验

烟草大田实验设计三个处理：不加镉加菌的处理S、S+2Cd（加2 mg/kg Cd2+不加菌）及S+2Cd+WH16-1（加2 mg/kg Cd2+不加菌）。实验田选在恩施望城坡，采用“X”法采集5 个地点的土样，以井窑式种植烟草。田地起陇覆膜平衡好后，使用打孔机在陇上均匀打孔，按实验设计将硝酸镉溶液和菌剂WH16-1 分别施入孔内并与周围土壤拌匀，不加硝酸镉和菌液的处理中加入等量的去离子水，每个孔加入500 mL 水，按40 g/株添加复合肥（复合肥N2O∶P2O5∶K2O =10∶10∶20），拌匀后覆盖土壤，防止晒干，并做好标记。每个处理选取34 株烟苗，不同处理之间隔两株作为保护，每两株间的行间距为80 cm，株间距为30 cm。按田间烟草正常生长管理模式进行管理，在烟草成熟期（90 d）取烟样及土样。

1.4 分析方法与实验数据处理

在烟草成熟期（盆栽120 d，大田90 d）测量株高、株茎、叶片数并记录。烟草取样后，将其分成根、茎、叶并清洗晾干，在110 ℃杀青30 min 后以70 ℃烘干至恒重，测量烟草的干重并进行比较。

盆栽土壤中镉、速效磷、碱解氮、有机质含量及土壤pH 分别为：2±0.57 mg/kg、3.65±0.24 mg/kg、310.99±10.48 mg/kg、20.66±2.57 g/kg 和7.88±0.13。大田土壤中的上述物质分别为：3±0.18 mg/kg、2.43±0.14 mg/kg、47.80 ±8.08mg/kg、20.86 ±0.71g/kg 和8.02±0.13。

实验数据采用spss17.0 进行显著性分析，其中方差分析采用One-Way、ANOVA、Duncan 检测法对各处理间数据进行比较分析，显著性水平为P＜0.05，显著性差异用不同的小写英文字母进行标示。图表用Origin 8.0 绘制。

2 结果与讨论

2.1 施加微生物菌剂对土壤中各形态镉含量分布的影响

在盆栽烟草种植后120 d，土壤中各形态镉含量的分布如图1（A）所示。处理组S+WH16-1 与S相比，可交换态镉及碳酸盐结合态镉的含量分别显著降低了20.42 %、12.73 %（P＜0.05），铁锰氧化物结合态镉的含量基本无变化，有机结合态镉及残渣态镉分别显著增加了38.88 %和32.34 %（P＜0.05）。处理组S+2Cd+WH16-1 与S+2Cd 相比，土壤中可交换态镉显著降低10.40%（P＜0.05），碳酸盐结合态镉降低7.81 %，铁锰氧化物结合态镉、有机结合态镉、残渣态镉分别增加19.60 %、22.76 %、27.20 %。其中，铁锰氧化物结合态镉、残渣态镉含量的降低达到显著水平（P＜0.05），这种修复效果与许多研究报道的结果相一致，证明通过添加修复剂改变土壤中重金属的化学形态，可以改善土壤的理化性质，减少对植物的毒害。

图1 细菌对盆栽（A）及大田（B）土壤中Cd 的形态的分布影响

处理组S+6Cd+WH16-1 与S+6Cd 相比，施加菌剂WH16-1 使土壤中可交换态镉降低1.14 %，碳酸盐结合态镉显著降低7.55 %（P＜0.05），铁锰氧化物结合态镉、有机结合态镉、残渣态镉分别增加3.02%、28.20 %、19.20 %。结果表明，菌剂WH16-1 对高浓度镉污染土壤的修复效果不如对低浓度镉污染土壤的。细菌WH16-1 对Cd 的最大抗性为9 mg/L，高浓度镉抑制了其生长。因此，该细菌产生的H2S 少，不利于CdS 的生成。而该细菌及其分泌物的表面官能团少，也不利于其与Cd 发生络合固定。

2.2 施加微生物菌剂对植物农艺性状的影响

盆栽烟草和大田烟草的株高及生物量结果如图2 所示。对比图2（A）和图2（C）中对照组S 与加菌组S+WH16-1 发现，加菌后株高显著增加14.77 %（P＜0.05），生物量增加11.99 %；处理组S+2Cd+WH16-1 与S+2Cd 相比，加菌组的株高及生物量分别显著增加12.13 %、14.77 %（P＜0.05）；处理组S+6Cd+WH16-1 与S+6Cd 相比，加菌组株高及生物量分别增加10.83 %、4.44 %。

图2 菌剂WH16-1 对烟草成熟期株高及生物量的影响

从图2（B）和图2（D）中可以看出，不加菌不加镉处理的对照组（S）的生物量及株高均不如实验组。处理组S+2Cd 与加菌处理组S+2Cd+WH16-1 相比，加菌后烟草株高增加3.92 %，生物量显著增加9.23%（P＜0.05）。

2.3 施加微生物菌剂对植物体内镉含量的影响

在盆栽和大田烟草成熟期（90 d 和120 d）分别取烟草样品，其不同部位的镉含量如图3，只加镉处理组中烟草根、茎、叶及总镉的含量相对于不加镉的空白对照组均有所增加。

图3 菌剂WH16-1 对烟草各部位镉含量的影响

从图3（A）中可以，看出120 d 时，不加镉的对照组S 中烟草根、茎、叶中的镉含量分别为114 μg/kg、81 μg/kg、75 μg/kg，处理组S+WH16-1 中各部位的镉含量分别为100 μg/kg、76 μg/kg、48 μg/kg，相对于不加菌的对照组分别降低12.28 %、6.17 %、18.52 %；处理组S+2Cd 中各部位的镉含量分别为331 μg/kg、118 μg/kg、102 μg/kg，处理组S+2Cd+WH16-1 中各部位的镉含量分别为167 μg/kg、86 μg/kg、48 μg/kg，相对于只加镉的对照组分别显著减少49.54 %、27.12 %、52.94 %；处理组S+6Cd 中各部位的镉含量分别为710 μg/kg、202 μg/kg、150 μg/kg，处理组S+6Cd+WH16-1 中各部位的镉含量分别为603 μg/kg、185 μg/kg、85 μg/kg，相对于只加镉的对照组依次减少16.07 %、8.42 %、43.33 %。加菌处理后叶片中的镉含量均降到烟叶中镉含量的允许标准（0.2 mg/kg）以下，且均达到显著水平（P＜0.05）。

据3（B）可知，土壤中外源添加镉后，植株各部位对镉的吸收均有所增加。

上述结果表明，土壤中的镉污染越严重，烟草对镉的吸收越多；烟草中的镉含量为根＞茎＞叶；添加菌剂WH16-1 可以减少烟草对镉的吸收。

2.4 施加微生物菌剂对烟草植物体内酶活的影响

盆栽烟草120 d 叶片酶活测定结果如图4（A）所示。对照组S 与加菌组S+WH16-1 相比，添加菌剂WH16-1 叶片中的叶绿素（Chl）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）分别增加6.94 %、25 %、23.96 %，戊二醛（MDA）含量显著降低44.52%（P＜0.05）。处理组S+2Cd+WH16-1 与S+2Cd 相比，添加菌剂WH16-1 后过氧化氢酶显著增加42.86 %（P＜0.05），叶绿素和超氧化物歧化酶略增加6.45 %和8.75 %，戊二醛仅降低2.35 %。处理组S+6Cd+WH16-1 与S+6Cd 相比，超氧化物歧化酶显著增加78.98 %（P＜0.05），叶绿素和过氧化氢酶略增加19.61 %和4.55 %，丙二醛降低4.65 %（P＜0.05）。

图4 烟草成熟期植物叶部酶活的比较（A，盆栽；B，大田）

对比图4（B）中处理组S+2Cd+WH16-1 与S+2Cd 发现，施加菌剂WH16-1 后，叶片中叶绿素含量显著增加32 %（P＜0.05），过氧化氢酶活性增加1.86%，丙二醛含量降低19.46 %。

相比于对照组，加入菌剂WH16-1 后，烟草中丙二醛含量降低，说明烟草细胞膜受到伤害少。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶都是帮助植物抵抗膜脂过氧化的重要保护酶，它们组成了一个有效的活性氧自由基清除系统，能够快速清除活性氧，降低植物在逆境条件下的受损程度。菌剂WH16-1 的加入改变了土壤中镉的化学形态，减少了能够被植物直接利用的镉的浓度，烟草受低有效态镉的影响，清除活性氧的酶系统活性增强，有关酶浓度变大，用以清除镉胁迫下烟草植株内产生的过多的活性氧，减少细胞膜的脂质过氧化使MAD 浓度降低，缓解了Cd 胁迫对烟草的毒害作用。此外，菌剂WH16-1 的加入使烟草中的叶绿素含量升高，不仅有利于烟草的光合作用，也提升了其生物量。

3 结论

在镉污染土壤中施加硫酸盐还原菌WH16-1不仅降低了土壤中交换态镉和碳酸盐结合态镉的含量，增加了铁锰氧化物结合态镉、有机结合态镉和残渣态镉的含量，还有效固定了土壤中的镉，降低土壤中镉的生物有效性；同时，增加了烟草的生物量，减少了其根茎叶对镉的吸收，降低了烟叶中的镉含量。