艾绒的HPLC 指纹图谱及主要成分含量测定

★ 姚闽 袁铭铭 吴西 雷景邦 白吉庆（.江西省药品检验检测研究院/国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室/江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心 南昌 009；.江西省药品监督管理局 南昌 009；.陕西中医药大学 陕西 咸阳 7046）

艾叶为菊科蒿属植物艾Artemisia argyiLevl. et Vant.的干燥叶，可温经止血，散寒止痛［1］。艾叶主要含有黄酮、挥发油、有机酸、三萜等成分［2-5］。艾叶具有止血、解热镇静、平喘镇咳、祛痰、抗凝血、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用［4-6］。艾绒是由艾叶料剔除尘土粗梗、粉碎后，过筛除叶肉、叶脉和叶梗等粉末得到筛上层艾绒［7］。目前市场上出售的艾绒，多约定俗成采用叶绒比作为艾绒质量评判的一个要素，市面上的艾绒多数标以比例2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、30∶1，如叶绒比2∶1 表示将2 kg 艾叶制备得到1 kg 的艾绒，即艾绒在加工过程中筛掉的杂质越多，得到的艾绒量越低，艾绒的纯度就越高，质量越好。目前，主要对其挥发性成分、粉碎度、燃烧值以及氮元素进行研究［8-12］，而对其非挥发性成分黄酮类和酚酸类成分未进行研究。基于此，通过HPLC 构建艾绒的指纹图谱，并对23 批不同艾绒样品中7 个指标成分（黄酮类和酚酸类）进行含量测定，为艾绒的等级评价和质量控制提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1260 型HPLC 仪，ME204TE 型XSE-205 型电子天平，HH-6 型六孔数显恒温水浴锅，DFY-1000C 高速摇摆式粉碎机。

1.2 主要药品与试剂

隐绿原酸（批号CFN99117，纯度99.0%）、异绿原酸B（批号CFN99119，纯度99.2%）、异绿原酸A（批号CFN99118，纯度99.5%）、异绿原酸C（批号CFN99120，纯度98.5%）、宗矢车菊素（批号CFN90386，纯度99.5%）、异泽兰黄素（批号CFN99117，纯度99.2%）均购于上海洽姆仪器科技有限公司；绿原酸（批号110753-202018，纯度96.1%）购于中国食品药品检定研究院。

本研究所有样品均由江西省药品检验检测研究院万林春鉴定为植物艾的干燥叶。参考艾绒制备工艺流程，采用DFY-1000C 高速摇摆式粉碎机将各批次艾叶粉碎，将粉碎的艾叶过筛，过筛后剩余艾绒制成不同叶绒比的艾绒饮片，具体艾绒信息见表1。

表1 23批不同叶绒比等级的艾绒信息

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品的制备 精密称取艾绒0.5 g，置于具塞锥形瓶，加入50 mL 80%甲醇，首次称重，采用加热回流法回流1 h，放冷，再次称重，采用80%甲醇补重，摇匀，过滤。

2.1.2 混合对照品的制备 精密称取绿原酸、异绿原酸A、隐绿原酸、异泽兰黄素、异绿原酸B、宗矢车菊素、异绿原酸C 7 个成分对照品，加80%甲醇制成含绿原酸对照品浓度为0.022 2 mg/mL、异绿原酸A 对照品浓度为0.008 3 mg/mL、隐绿原酸对照品浓度为0.014 6 mg/mL、异泽兰黄素对照品浓度为0.035 6 mg/mL、异绿原酸B 对照品浓度为0.034 7 mg/mL、宗矢车菊素对照品浓度为0.008 0 mg/mL 和异绿原酸C 对照品浓度为0.020 4 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.1.3 空白溶液 以80%甲醇溶液作为空白溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18MG Ⅱ S5（4.6 mm×250 mm, 5 μm），洗脱溶液：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），条件（0～12 min，13%A；12～15 min，13%→21%A；15～40 min，21%A；40～60 min，21%→70%A）；柱温：30℃；检测波长：330 nm；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。

2.3 专属性考察

精密吸取按“2.1”项下所制备的空白、供试品、混合对照品等溶液，并采用“2.2”项下色谱方法进行检测。各成分的分离度良好（理论塔板数按绿原酸色谱峰计不低于5 000），空白溶液对待测成分均无干扰，表明专属性较好。见图1。

图1 HPLC色谱图

2.4 指纹图谱的建立及分析

2.4.1 方法学考察 精密称取艾绒样品（编号AR-1）0.5 g，按“2.1.1”项下制备供试品，采用“2.2”项下色谱方法，连续进样6次，以异绿原酸C（9号峰）为参照峰，测得12 个共有峰的相对峰面积、相对保留时间的RSD均小于2.0%（n=6），表明精密度较好。取同一艾绒样品（编号AR-1）的供试品溶液，在室温下放置0，2，4，8，12，24 h，按照“2.2”项下色谱方法测定，12 个峰与上述指标的RSD均小于2.0%（n=6），表明在室温下，该样品放置24 h 内稳定。称取同一艾绒样品（编号AR-1）6 份，每份0.5 g，精密称定，按“2.1.1”项下制备供试品，利用“2.2”项下色谱方法测定，RSD均小于2.0%（n=6），表明该方法的重复性较好。

2.4.2 HPLC 指纹图谱的构建和相似度评价 从23 批艾绒中分别称取0.5 g，按“2.1.1”项下供试品溶液方法制备，采用“2.2”项下色谱方法检测。将23 批艾绒图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版），以S12图谱为参照，采用中位数法自动匹配，生成并对照指纹图谱，进行相似度评价。同时，确认对照指纹图谱色谱峰，确定12 个共有峰，并以9 号色谱峰（异绿原酸C）作为参照峰，比对对照品的保留时间和色谱峰，指认了其中7 个共有峰，为绿原酸（2 号峰）、隐绿原酸（3 号峰）、异绿原酸B（6 号峰）、异绿原酸A（8 号峰）、异绿原酸C（9 号峰）、宗矢车菊素（11 号峰）和异泽兰黄素（12 号峰）。各图谱与对照图谱相似度为0.885～0.998，可见23 批艾绒具有较高相似度。23 批艾绒对照与叠加指纹图谱、相似度评价见图2、表2。

图2 23批艾绒的对照与叠加指纹图谱

表2 23批艾绒指纹图谱的相似度评价

2.5 7 个成分的含量测定

2.5.1 线性范围考察 取混合对照品溶液1、2、5、10、20、30 µL，采用“2.2”项下色谱方法进行检测，以7 个成分的进样量为横坐标（X），成分的峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，各成分具有较好的线性关系。见表3。

表3 艾绒中7个成分方法学考察参数

2.5.2 精密度试验 精密称取艾绒样品（编号AR-1）0.5 g，按 “2.1.1”项下供试品溶液的方法制备，采用“2.2”项下色谱方法检测，连续进样6 次。结果7 种成分峰面积的RSD（n=6）分别为0.33%、0.42%、0.17%、0.51%、0.36%、0.62%、0.25%，说明检测仪器的精密度较好。

2.5.3 重复性试验 称取同一艾绒样品（编号AR-1）6 份，每份0.5 g，分别按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法，然后按照“2.2”项下色谱方法测定，记录7 个成分的峰面积，并计算含量（外标法）。结果7 种成分峰面积的RSD（n=6）分别为0.52%、1.03%、0.42%、0.37%、0. 28%、0.72%、0.41%，均小于2%，表明该方法的重复性较好。

2.5.4 稳定性试验 取同一艾绒样品（编号AR-1），按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法，制备后在室温下放置0、2、4、8、12、24 h，采用“2.2”项下色谱方法检测。7 个成分峰面积的RSD（n=6）分别为0.62%、0.89%、0.43%、0.37%、0. 29%、0.74%、0.46%，均小于2%，表明该艾绒样品在室温下24 h之内较稳定。

2.5.5 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的艾绒样品（编号AR-1）0.25 g，各6 份，按已知量的100%分别加入相对应的混合对照品溶液含绿原酸（0.011 1 mg/mL）、隐绿原酸（0.004 2 mg/mL）、异绿原酸B（0.007 3 mg/mL）、异绿原酸A（0.017 8 mg/mL）、异绿原酸C（0.017 4 mg/mL）、宗矢车菊素（0.004 mg/mL）、异泽兰黄素（0.010 2 mg/mL）50 mL，按 “2.1.1”项下供试品溶液的方法制备，采用“2.2”项下色谱方法检测，计算加样回收率。见表4。

表4 艾绒中绿原酸等7个成分加样回收率试验结果（n=6）

2.5.6 艾绒样品中7 个主要黄酮类和酚酸类成分的含量测定 取23 批艾绒样品，按“2.1.1”项下供试品溶液的制备方法，采用“2.2”项下色谱方法检测，计算艾绒样品中7 个成分的含量（外标法）。见表5。

表5 艾绒中7个成分的含量测定（n=3） mg/g

3 讨论

3.1 样品提取方法的优化

采用30%、50%、80%、100%甲醇以及乙醇、水提取艾绒，发现采用80%甲醇提取时，各个色谱峰的分离度较好，化合物信息量最多。因此，选择80%甲醇提取艾绒样品。分别考察超声提取和回流提取，发现两者色谱峰峰面积有较大差别，超声提取法的峰面积明显小于回流提取法，7 个主成分的含量更高，故本研究选择回流提取法提取艾绒样品。考察提取样品时间（30、60、90 min）、料液比（1∶50、1∶100、1∶200 g/mL）对色谱峰影响，研究选择60 min，1∶100 g/mL 提取。

3.2 色谱条件的优化

考察3 种流动相体系（乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水），采用乙腈-0.1%磷酸溶液洗脱分离度较好，化合物信息量更大。同时，DAD检测器扫描在200～400 nm 范围内，发现12 个共有峰均在330 nm 附近有较大吸收，且各待测成分与其他成分的色谱峰分离较好，因此以330 nm 为检测波长。

3.3 指纹图谱分析及主成分含量测定结果分析

指纹图谱作为整体、稳定的化学鉴别手段，在中药材和中成药的质量控制中具有非常重要的作用，为此构建23 批艾绒样品的HPLC 指纹图谱，共确认12 个共有峰，并进行相似度评价。结果本研究共指认7 个成分，23 批样品的相似度均大于0.885，表明不同叶绒比的艾绒具有较高相似度，但是叶绒比增大，相似度减少。为进一步考察艾绒的质量，并建立相应的含量测定方法，并对23 批次不同艾绒进行了测定，虽然指纹图谱的相似均较高，但不同批次的各成分的含量差异较明显，同时指纹图谱相似度和各成分含量测定结果显示，叶绒比越大，相似度和含量越低，这可能与艾绒在加工制备时需要不断地过筛，筛除掉艾粉和艾渣，艾粉主要为艾叶的叶肉组织，其内含有大量的有机成分。因此，叶绒比越大的艾绒，所含的杂质和艾粉越少，其相似度和各成分含量就越低。

综上，本研究建立的方法，简便、准确、可靠，且艾绒指纹图谱和主要成分含量测定可为艾绒等级的鉴定提供新的参考依据。