鱼类病毒(SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV)LAMP联检方法的建立和应用

时国强,张 妍,李贺杰,焦义然,张 璜,张 婵,石 磊,董振国

(1.河北三狮生物科技有限公司,河北 石家庄 050035;2.河北师范大学生命科学学院,河北 石家庄 050024;3.河北科技大学食品与生物学院,河北 石家庄 050018)

0 引言

近年来,我国渔业综合产值呈持续增长趋势,2021年全国渔业综合产值为2.96万亿元,而淡水养殖几乎占一半,但各种疾病对养殖产业形成较大影响,其中鲤春病毒血症、锦鲤疱疹病毒病、鲤浮肿病和病毒性神经坏死病严重威胁鲤科鱼类的养殖和发展,也造成巨大的经济损失[1-3]。

鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)其基因组由负义单链RNA组成,传播快、宿主范围广,可引起急性、出血性传染病[4-7]。SVCV传染性强、死亡率极高,发现病鱼只能对其进行识别和扑杀[8]。鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus,CyHV)3型(CyHV-3)为dsDNA病毒,感染可引起高致病性、高传染性、高死亡率的疾病[9,10]。鲤浮肿病毒(carp edema virus,CEV),是线性双链DNA(dsDNA)病毒,可诱发致死率高达80%以上的鲤浮肿病[11-13]。病毒性神经坏死病病毒(viral nervous necrosis virus,VNNV)是一种神经坏死病毒属β诺达病毒[14]。现阶段对这4种病毒的诊断方法为PCR/RT-PCR,但操作复杂,不适合基层人员的快速诊断。

随着集约化养殖迅速发展,这4种病毒的传播,给鲤科养殖产业造成巨大的经济损失,而且鲤浮肿病病症与锦鲤疱疹病毒病症状非常相似[15],给防护工作增加了难度,所以一种灵敏度高,准确度高的检测方法,对该病毒诊断防控是非常重要的。目前PCR是仍精准的基因诊断方法[16,17],然而该方法操作复杂,对仪器和人员要求较高,不适合基层进行快速诊断。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在恒温条件下(60℃左右)即可启动链置换DNA合成,并在1 h左右内完成 DNA大量扩增的方法[18]。目前,环介导等温扩增技术已逐渐步入了产业化、商品化的时代[19,20]。

本研究针对SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的蛋白编码基因序列各设计3对特异性引物,通过筛选和反应温度、引物浓度等优化测试,建立一个可以同时检测以上4种病毒的LAMP检测方法,为SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的现场快速诊断奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 测试质粒DNA

在NCBI中查找4种病毒的基因组序列:SVCV(GenBank: EF593145.1)、CyHV-3(GenBank:MK733802.1)、CEV(GenBank: MF326541.1)和VNNV(GenBank: AY744705.1),用BLAST进行序列比对筛选保守区域,将保守序列交由上海生工进行质粒合成。

1.1.2 主要试剂

Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs公司),甜菜碱(Betaine,Sigma公司),MgCl2(Sigma公司),dNTPs(宝生物工程(大连)有限公司),SYTO-9(life technology公司),LAMP引物(生工生物工程(上海)有限公司),总DNA/RNA提取试剂(河北三狮生物科技有限公司),All-in-one逆转录试剂(河北三狮生物科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器

-80℃冻存柜(thermo fisher scientific),高速台式离心机(thermo fisher scientific),漩涡混合器(德国IKA公司),微量移液器(德国Eppendorf公司),超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),荧光PCR仪器ABI7500(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物设计

将SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的序列保守区域,使用LAMP Designer软件设计特异引物,引物交由上海生工合成。各引物序列见表1—表4。

表1 SVCV LAMP扩增的引物序列

表2 CyHV-3 LAMP扩增的引物序列

表3 CEV LAMP扩增的引物序列

表4 VNNV LAMP扩增的引物序列

1.2.2 LAMP引物筛选及反应体系的建立

参考文献[21]的数据,初步确定25 μL的LAMP反应体系,其成分包括:FIP和BIP各1.6 μM,F3和B3各0.2 μM,FLP和BLP各0.8 μM,20 mM Tris-HCl(pH8.8),10 mM KCl,8 mM MgSO4,10 mM (NH4)2SO4,0.1% Tween20,1 M甜菜碱,6 mM MgSO4,1.6 mM dNTP,8U Bst大片段DNA聚合酶,2 μL核酸。

本研究采用恒温荧光法进行引物筛选和检测,具体步骤如下:

1)根据设计的3套引物,分别配制加环引物和不加环引物的引物混合液,在不加环引物的引物混合液中,浓度比为外引物∶内引物=1∶8,在加环引物的引物混合液中浓度比为外引物∶环引物∶内引物=1∶4∶8。

2)试剂配制具体操作如下:先在冰上准备LAMP反应混合液,扩增反应体系如下:12.5 μL反应液RM,8.0 μL超纯水DW,0.5 μL SYTO-9,1 μL引物PM,1 μL Bst酶以及2 μL模板(浓度为1 pg/μL)。将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后,每管分装23 μL,加入20 μL密封液后再分别加入2 μL模板。最后参照ABI 7500使用说明书,将混合物置于反应孔中,63 ℃恒温反应60 min。

1.2.3 LAMP灵敏度和特异性实验

取SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的浓度为1 ng/μL质粒作为初始浓度,用TE缓冲液10倍梯度稀释质粒至0.1 fg/μL。用DEPC处理水作为阴性对照(NG),按照1.2.2中的反应体系和步骤进行灵敏度实验。以鲤春病毒血症病毒,鲤疱疹病毒,鲤浮肿病毒,病毒性神经坏死病病毒,草鱼呼肠孤病毒,虹彩病毒,爱德华氏菌DNA,孢子虫病,副溶血弧菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,鳕鱼,马哈鱼,比目鱼,鲱鱼的基因组作为LAMP反应的模板,用筛选出的LAMP引物作为引物,进行LAMP反应,63 ℃运行60 min,验证LAMP反应的特异性,利用荧光PCR仪器观察反应结果。

1.2.4 核酸提取

将收集到的疑似带有SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV病毒的样本进行预处理,使用总DNA/RNA提取试剂盒参照试剂盒说明书对样本进行核酸提取,将提取的核酸进行LAMP检测。

1.2.5 逆转录

将提取的SVCV、VNNV病毒的样本核酸进行反转录,使用All-in-one逆转录试剂,参照说明书进行反转录,将得到的cDNA进行LAMP检测。

1.2.6 LAMP样本检测实验

检测收集的150份含有疑似鲤春病毒血症病毒(SVCV),鲤疱疹病毒3型(CyHV-3),鲤浮肿病毒(CEV)和病毒性神经坏死病病毒(VNNV)的鱼组织样本核酸。以市售的各荧光定量PCR检测试剂盒为对照,对建立的4种病毒LAMP检测方法进行测试。

2 结果与讨论

2.1 LAMP引物筛选结果

使用设计的LAMP引物,采用1.2.2的反应体系,反应条件为63 ℃,60 min,每组引物各重复测试2次,进行LAMP引物筛选。实验结果如下所示:根据实时荧光扩增曲线(图1)和Ct平均值(表5)对比发现鲤春病毒血症病毒(SVCV)的引物SVCV1出峰早,且重复性好,故将引物SVCV1作为后续实验研究;鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)的CyHV-3-1和CyHV-3-2引物重复性好,但CyHV-3-1出峰早,CyHV-3-3的阴性对照有引物二聚体出现,所以筛选引物CyHV-3-1为最合适引物;鲤浮肿病毒(CEV)的引物CEV2出峰最早,故选引物CEV2进行后续实验研究;病毒性神经坏死病病毒(VNNV)中VNNV1引物出峰早,且重复性好,故选引物VNNV1为最合适引物并进行后续实验研究。

图1 SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的不同引物组扩增曲线

表5 不同引物组的Ct值

2.2 LAMP引物灵敏度测试结果

用DEPC处理水作为阴性对照(NG),取SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的浓度为1 ng/μL质粒作为初始模板浓度,用TE缓冲液10倍梯度稀释模板质粒至0.1 fg/μL进行测试,各梯度模板重复测试3次。结果显示,SVCV和CyHV-3均可稳定性检测到10 fg/μL,CEV和VNNV可稳定性检测到1 fg/μL,见表6。

表6 各梯度的Ct值

表7 各梯度的Ct值

2.3 LAMP特异性测试结果

以鲤春病毒血症病毒,鲤疱疹病毒,鲤浮肿病毒,病毒性神经坏死病病毒,草鱼呼肠孤病毒,虹彩病毒,爱德华氏菌DNA,孢子虫病,副溶血弧菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,鳕鱼,马哈鱼,比目鱼,鲱鱼的基因组作为LAMP反应的模板,使用筛选出的LAMP引物进行测试,63 ℃运行60 min,验证LAMP反应的特异性。结果显示,4种病毒所对应的核酸有扩增曲线,其余核酸均没有扩增结果,证明这4种病毒的引物均具有很好的特异性,如图2所示。

图2 4种病毒引物特异性扩增曲线图

2.4 LAMP样本检测实验结果

使用建立的4种病毒联合LAMP检测方法对收集的150份含有疑似SVCV,CyHV-3,CEV和VNNV的鱼组织样本核酸进行测试,以市售的各荧光定量PCR检测试剂盒平行测试结果为对照。结果显示SVCV阳性率为32%,CyHV-3阳性率为58%,CEV阳性率为64%,VNNV阳性率为20%,并且两种检测方法准确率为100%。

2.5 讨论

本实验在NCBI中查找出所有SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的全基因组序列,用BLAST进行序列比对,找出序列保守区域,进行LAMP引物的设计,通过LAMP Designer软件各设计3对引物,并进行实验筛选,通过对比测试各选出一组扩增效率更高的引物作为后续实验研究。而且LAMP引物有很好的特异性,通过实验测试发现设计筛选出的LAMP引物仅对SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV有特异性扩增。为了更全面的检测,本试验将鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)、鲤浮肿病毒(CEV)和病毒性神经坏死病病毒(VNNV)4种病毒进行整合,制成联检病毒诊断方法。通过实验发现,4种病毒检测结果不存在荧光信号干扰,特异性好,灵敏度高,而且LAMP方法适合现场检测。

随着我国生活水平的不断提高,人们对水产品的需求量也在逐年增长,国内的水产养殖随之得到快速发展。但大规模地发生传染性疾病,给养殖户带来了严重的损失[22,23]。鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)、鲤浮肿病毒(CEV)和病毒性神经坏死病病毒(VNNV)有着很强的传染性,尤其是对鲤科鱼类伤害最大[24]。现在市场上对于这4种病毒的诊断更多的是荧光定量PCR方法,对于仪器、人员要求高,导致成本也高。目前水产养殖过程中无论是SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV都没有非常有效的治疗方法,因此早发现,早防治才是避免以上病毒造成大面积水产死亡的最有效方法。

3 结论

本研究通过采用建立的4种病毒联合LAMP方法与实时荧光定量PCR方法对比试验,同时对150份鱼组织样本进行SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV检测,发现两种方法测得结果阳性率一致,准确率100%。建立的LAMP方法能准确、高效、快速的在鱼组织样本中检测出SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV,并且LAMP方法对仪器要求低,操作简单,检测时间短,非常适合水产养殖现场检测,对病毒的监测和诊断起到重要作用。