离子色谱-串联质谱法测定小麦粉中4种污染物

王 娟,王 敬,张 旭,陈 琛,谢雨泽,贾文轩

(河北省食品安全重点实验室,国家市场监管重点实验室(特殊食品监管技术),特殊食品安全与健康河北省工程研究中心,河北省食品检验研究院,河北 石家庄 050227)

0 引言

草甘膦是全球使用时间最长、使用范围最广的除草剂,因其高效、广谱、低毒、安全等特点,广泛应用于农作物去除杂草[1-3]。我国是草甘膦使用大国,草甘膦曾被列入“2A”类致癌物[4],尽管联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)农药残留联席会议(JMPR)证实草甘膦及其代谢产物氨甲基磷酸在一定时间内不会导致严重的健康问题[5,6],但草甘膦的安全风险仍然受到各国质疑[6-8],因此各国也在不断严格规定草甘膦残留限量标准。其中我国GB 2763—2021规定小麦粉中草甘膦的最大残留量为0.5 mg/kg。

近年来, 氯酸盐和高氯酸盐作为一类新型污染物, 引起越来越多的关注[9]。氯酸盐主要是使用含氯消毒剂消毒产生的副产物,影响人体的血液系统,造成溶血性贫血,也会阻碍甲状腺吸收碘[10,11]。高氯酸盐会阻碍甲状腺对碘的吸收, 削弱甲状腺功能, 影响人体生长发育[12,13]。因此2020年欧盟正式将高氯酸盐补充进关于食品污染物最大残留限量,(EU)2020/685 号条例中加工谷物类高氯酸盐限量为0.01 mg/kg[14]。氯酸盐作为农药已不再被欧盟批准使用,其默认的最大残留限量应遵循标准(EU)2020/749 号条例中的相关规定,其中小麦的最大残留量为0.05 mg/kg[15]。

草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐均属离子型污染物,都具有强极性、水溶性以及小分子的特点[16,17]。草甘膦、氨甲基膦酸为强极性两性农残,难挥发,我国现行的国家检测标准大多是使用液相色谱[18]、液相色谱-质谱联用[19,20]、气相色谱[21]、气相色谱-质谱联用[22],经衍生化后进行检测,操作相对繁琐。氯酸盐、高氯酸盐同样具有强极性、水溶性以及小分子的特点[23],常用的检测方法比色法[24]、离子色谱法[25]、液相色谱-质谱联用[26]、离子色谱-质谱联用[27]等。鉴于以上研究的基础,本文利用离子色谱-串联质谱技术建立同时测定小麦粉中草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐4种污染物的分析方法,方法采用甲醇水提取,经固相萃取净化后进行测定,该法简单、准确、灵敏度高,为市场中小麦粉的安全监管提供更有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草甘膦(纯度:99.8%,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、草甘膦1,2-13C15N(100 mg/L, BePure公司)、氨甲基磷酸纯度:99.8%, Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、氯酸盐(1 000 mg/L,o2si公司)、高氯酸盐(1 000 mg/L,o2si公司)、氯酸盐-18O3(200 mg/L,EURL-SRM公司)、高氯酸盐-18O4(200 mg/L,EURL-SRM公司)。

RP柱(1 mL,Thermo Scientific公司)、Ag/H(1 mL,Thermo Scientific公司)、IonPac AS19-4 μm 分析柱(250 mm×2 mm,Thermo Scientific公司)、AG 19-4μm保护柱(50 mm×2 mm)、IonPac AS11-HC-4 μm 分析柱(250 mm×2 mm,Thermo Scientific公司)、AG 11-HC-4 μm保护柱(50 mm×2 mm)、IonPac AS11-4 μm 分析柱(250 mm×2 mm,Thermo Scientific公司)、AG 11-4 μm保护柱(50 mm×2 mm)。甲醇、乙腈(色谱纯,Meck)。

1.2 仪器与设备

Dionex ICS-5000+离子色谱仪, EG淋洗液自动发生器,Dionex ASRS 300 (2mm)微膜抑制器, AS-AP自动进样器,美国Thermo Scientific公司;TSQ Endura质谱仪(Thermo Scientific);涡旋混匀器,IKA;离心机,SiGMA 3K15;超声波清洗仪,ElmasonicP 300H;电子天平(美国Mettler Toledo公司);离心机(德国Merck公司);Milli-Q纯水(德国Merck公司);涡旋振荡器(德国Heidolph公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配置

实验前分别将草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐、草甘膦1,2-13C15N、高氯酸盐-18O4、氯酸盐-18O3用超纯水配置成需要的标准工作液。

1.3.2 样品前处理

称取5 g小麦粉样品于50 mL 聚丙烯塑料管中,加入 10 mL 纯水,涡旋 2 min。再加入10 mL甲醇,混匀,超声提取 20 min。离心,取1 mL上清液用纯水定容至10 mL,混匀,待净化。

固相萃取柱使用前需进行活化,RP柱使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水通过,Ag/H柱用10 mL水通过,静置活化30 min[28]。取上述前处理滤液通过RP柱,Ag/H柱,弃去前面6 mL,收集后面洗脱液,通过0.2 μm再生纤维素滤膜后待测。

1.3.3 分析方法

1)离子色谱条件

色谱柱:Dionex IonPac AS 19-4 μm分析柱(250 mm×2 mm)、AG 19-4 μm保护住(50 mm×2 mm);流速为0.2 mL/min;进样量为100 μL;柱温为30 ℃;阴离子微膜抑制器,外接水循环模式,流动相:KOH溶液,采用梯度洗脱的方法进行分离,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2)质谱条件

离子源:ESI-;扫描模式:MRM;负离子电离电压3 000 V;离子传输管温度380 ℃;雾化器温度350 ℃;鞘气流速30 mL/min;辅助其流速10 mL/min;反吹气流速1 mL/min;草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐的质谱参数见表2。

表2 草甘膦、氨甲基磷酸、氯酸盐、高氯酸盐的质谱参数

3)数据分析方法

使用TraceFinder 3.2 software数据分析软件进行数据分析;草甘膦、氯酸盐、高氯酸盐使用内标法定量,氨甲基膦酸使用外标法定量。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱参数的优化

采用电喷雾(ESI)离子源,在选择反应监测模式下,对质谱条件进行优化,4种污染物容易减H形成负电荷离子,因此将4种污染物的混合标准溶液,在ESI-模式下进行扫描确定母离子,然后进行二级质谱扫面确定子离子,同时优化RF Lens和CE等质谱参数,见表2。目标物的提取离子流图如图1所示。

图1 氨甲基膦酸、草甘膦、高氯酸盐、氯酸盐标准溶液的提取离子流图

离子色谱仪的流动相为纯水,经KOH在线发生器后产生强碱KOH,后经过抑制器变为纯水,与质谱常用的甲醇、乙腈等有机溶剂相比,对检测物的离子化效率的促进作用较弱,因此在抑制器后,质谱进样口前接三通,利用计量泵输入有机溶剂,进入质谱促进电离。分别实验有机溶剂甲醇、乙腈,发现使用甲醇会增加抑制器背压,减少抑制器寿命,所以选用有机溶剂乙腈。计量泵的输入乙腈流速0.1 mL/min、0.15 mL/min、0.2 mL/min,发现0.15 mL/min、0.2 mL/min均可提高检测物的响应,考虑到抑制器的背压,计量泵流速选择0.15 mL/min。实验比较了50 ng/mL响应变化情况,结果见表3。

表3 草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐的响应

2.1.2 离子色谱条件的优化

因为色谱柱需接入质谱仪,选择2 mm×250 mm色谱柱,同时配置2 mm阴离子抑制器。该方法比较了AS11-HC-4 μm、AS19-4 μm、AS11-4 μm三种色谱柱,分别检测了50 ng/mL的混合标准样品和小麦粉基质样品,发现相同条件下,AS11-4 μm上氯酸盐和高氯酸盐保留较弱,AS11-HC-4 μm上标液高氯酸盐不能洗脱,AS19-4μm,均可实现分离,因此选择AS19-4 μm作为分析柱。

2.2 前处理条件的优化

4种污染物均属于强极性化合物,均极易溶于水,常采用纯水作为提取溶剂,然而小麦粉中含有大量的蛋白质和脂肪, 样品提取液中残留的蛋白质会影响分离效果。因此采用甲醇∶水(1∶1)作为提取溶剂。

实验中进样量为100 μL,会产生溶剂效应,影响目标物的峰型,小麦粉经甲醇水提取后,用纯水稀释10倍,获得更好的峰型。参考相关文献[26,29,30],本研究采用固相萃取柱的方法,IC Guard RP 柱通过疏水作用去除小麦粉提取液中亲脂型杂质, 来降低基线和获得更好的分离效果。

2.3 基质效应的评价

用纯水及空白小麦粉基质提取液配制混合标准溶液,按照试验方法进行测定,根据纯水中分析物的峰面积与基质中分析物的峰面积比来评价基质效应。4种污染物的浓度为50 ng/mL,平行测定3次。结果显示,平均基质效应在85%～125%,结果见表4。为消除基质效应对检测结果所产生的影响,试验采用空白基质加标法进行定性定量,使目标物具有相同的离子化条件,提高准确度。

表4 基质效应

2.4 线性范围及检出限

用小麦粉空白基质液配置成0.02～200 ng/mL系列混合标准工作液,按照 1.3.3分析方法进样分析。发现草甘膦在0.5～100 ng/mL,氨甲基膦酸在1～200 ng/mL,氯酸盐在0.16～200 ng/mL,高氯酸盐在0.08～100 ng/mL范围内线性良好,均可符合实验要求。以3倍信噪比和10倍信噪比得出检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表5 。

表5 线性范围及检出限与定量限

2.5 回收率与精密度

选取空白小麦粉为基质,进行加标回收试验,每个添加浓度水平下做 6个平行样品。精密度及回收率数据见表6。由表6可知,4种污染物加标回收率为75.0%～109.0%,相对标准偏差为1.9%～10.4%,所建方法各项性能参数满足检测需求。

表6 草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐的加标回收率与精密度

2.6 市售样品的检测

按照1.3节实验方法对从市场随机采购的10批次小麦粉中草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐含量进行测定,结果见表7。由表7可知,10批次小麦粉中氨甲基膦酸含量小于检出限;有9批次样品检出草甘膦,含量在42.6～168 μg/kg,均符合我国GB 2763—2021最大残留量的要求;有5批次的样品检出氯酸盐,含量在8.8～55.1 μg/kg;有7批次的样品检出高氯酸盐,含量在4.0～96.9 μg/kg;其中1批次的样品中氯酸盐、高氯酸盐的含量均高于欧盟规定的最大残留量,而我国的国家标准还未做出氯酸盐、高氯酸盐的限量要求,因此该方法可对小麦粉市场的监管提供技术支持。

表7 小麦粉中草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐、高氯酸盐测定结果

3 结论

本方法经甲醇水提取, 结合固相萃取净化方法, 建立了离子色谱-串联质谱法同时测定草甘膦、氨甲基膦酸、氯酸盐和高氯酸盐的分析方法。该方法分离度良好, 具有较好的精密度和准确度。前处理操作简便,无需经过衍生化,可以为小麦粉的安全监管提供技术支持。