小儿咳喘灵颗粒中山银花检查方法的研究

胡 凤 韩志双 钟姝霞 陈建平

四川省自贡检验检测院，四川 自贡 643000

金银花与山银花均为忍冬科忍冬属植物，金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，二者在一些功效方面存在相同性[1]。2005版之前的《中国药典》将山银花收载于金银花项下，山银花为2010年中国药典新收载的品种。因此，在金银花的实际应用中，存在着金银花与山银花混用的现象。

小儿咳喘灵颗粒由麻黄、金银花、苦杏仁、板蓝根、石膏、甘草、瓜蒌七味中药组成，具有宣肺、清热，止咳、祛痰、平喘之功效，用于上呼吸道感染，气管炎，肺炎，咳嗽等[2～3]。经调研发现，同规格的小儿咳喘灵颗粒的市售价格由5元至30元不等，价格差距较大，而金银花的价格较山银花贵，因此不排除有些企业为了降低成本，用山银花代替金银花投料的可能。因此，有必要开展小儿咳喘灵颗粒中山银花检查方法研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪，Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器，AB 3000-4000QTRAP液相色谱-质谱联用仪，XSE-205梅特勒电子天平，UPR-II-20L纯水仪，SCQ超声波清洗器。

1.2 试药 灰毡毛忍冬皂苷乙(批号：111814-202106，含量96.1%，中国食品药品检定研究院)；乙腈、甲酸为色谱纯；水为超纯水；甲醇等试剂为分析纯。实验用中药饮片麻黄、金银花、苦杏仁、板蓝根、石膏、甘草、瓜蒌、山银花为市售饮片。收集小儿咳喘灵颗粒10批，均为市售品种，分别来自10个不同生产厂家。

2 方法与结果

2.1 HPLC-ELSD法色谱条件 色谱柱：月旭 Xtimate C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(B)、水(A)；梯度洗脱条件：20% B→28% B(0～8 min)，28% B→33% B(8～21 min)，33% B(21～24 min)，33% B→20% B(24～26 min)；流速为1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量：10 μL；不分流模式；漂移管温度：106 ℃；气体流量：2.2 mL/min。

2.2 LC-MS/MS法色谱条件 色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(28∶72)；流速为0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量为5 μL。

2.3 LC-MS/MS法质谱条件 电离方式：电喷雾负离子模式；检测方式：多反应检测(MRM)；气帘气SUR(psi)：25；雾化气(psi)：60；辅助加热气(psi)：60；离子源电压(V)：4500(-)；辅助加热气温度：550 ℃；定性离子对、定量离子、去簇电压DP、碰撞电压CE、出口电压CXP和离子化模式见表1。

表1 灰毡毛忍冬皂苷乙的主要质谱参数

2.4 HPLC-ELSD法对照品溶液的制备 精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙22.07 mg至25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备溶液。

2.5 HPLC-ELSD法标准曲线的制备 分别精密量取上述标准储备溶液1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2 mL至100 mL、50 mL、25 mL、10 mL及5 mL量瓶中，各加甲醇稀释至刻度。以峰面积对数值为横坐标，对照品浓度对数值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.6 LC-MS/MS法对照品溶液的制备 精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙20.01 mg至25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备溶液。

2.7 LC-MS/MS法标准曲线的制备 分别精密量取上述标准储备溶液1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、5 mL至100 mL、50 mL、25 mL、10 mL及10 mL量瓶中，各加甲醇稀释至刻度。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.8 供试品溶液的制备 取本品粉末2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.9 阳性供试品的制备 按照小儿咳喘灵颗粒生产工艺，分别掺入100%山银花、50%山银花、40%山银花、30%山银花、10%山银花、5%山银花及3%山银花，制成模拟小儿咳喘灵颗粒阳性样品，作为阳性样品1～阳性样品7，按照“2.8”项下方法制备成阳性供试品溶液。

2.10 专属性实验 精密吸取对照品、供试品及阴性样品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图，结果阴性样品无干扰，该方法专属性强(如图1所示)。

2.11 线性关系考察 HPLC-ELSD法以灰毡毛忍冬皂苷乙对照品峰面积对数值为横坐标，对照品浓度对数值为纵坐标，绘制标准曲线。线性方程：y=0.8489x-0.6514，r2=0.99；LC-MS/MS法以灰毡毛忍冬皂苷乙对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。线性方程：y=1659.21347x+ 16424.09941，r=0.99897，表明建立的 HPLC-ELSD法和LC-MS/MS法的线性良好。

图1 小儿咳喘灵颗粒中山银花检查高效液相色谱图

2.12 仪器精密度试验 将浓度为32.7342 μg/ mL对照品溶液，注入液相色谱仪，联系测定6次，记录峰面积，灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积的RSD分别为1.41%和1.05%，表明高效液相色谱仪及液相色谱-质谱联用仪的精密度良好。

2.13 方法精密度试验 取同一样品按照“2.8”项下方法制备8份供试品，进行测定，HPLC-ELSD法测得灰毡毛忍冬皂苷乙的平均含量为13.5033 mg/g，LC-MS/MS法测得灰毡毛忍冬皂苷乙的平均含量为13.3190 mg/g，8份供试品溶液含量的RSD分别为2.2%和1.9%，表明本方法的精密度良好。

2.14 稳定性试验 取同一份样品供试品溶液，在室温下，分别在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h进样，计算灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积的RSD，HPLC-ELSD法和LC-MS/MS法分别为3.4%和4.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.15 加样回收试验 按照“2.8”项下方法分别称取3份样品约2 g(样品7)，精密称定，置具塞锥形瓶中，按照表2精密加入灰毡毛忍冬皂苷乙对照品，进行测定，计算灰毡毛忍冬皂苷乙的平均回收率分别为100.9%及102.9%，表明方法的准确度良好。

2.16 样品测定 取7批模拟阳性样品及10批市购小儿咳喘灵颗粒样品进行测定，以标准曲线计算含量。结果见表3。

表2 灰毡毛忍冬皂苷乙加样回收试验结果

表3 样品测定结果

2.17 LC-MS/MS法验证阳性样品 精密吸取2.1项下的对照品、供试品及阳性样品溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪测定，进行液质联用分析，记录质谱图，试验结果表明HPLC-ELSD法检出灰毡毛忍冬皂苷乙的样品，经高效液相色谱-质谱联用方法验证，均为灰毡毛忍冬皂苷乙阳性检出，而HPLC-ELSD法未检出灰毡毛忍冬皂苷乙的样品，高效液相色谱-质谱联用方法亦未检出。结果如图2所示。

图2 小儿咳喘灵颗粒中山银花检查质谱图

灰毡毛忍冬皂苷乙的3个定性离子对的相对丰度分别为7%、4%、6%；阳性样品3个定性离子的相对丰度分别为7%、4%、5%，表明阳性样品特征质谱碎片离子相对丰度与相应的对照品的特征质谱碎片离子相对丰度比较，处于特征质谱碎片离子相对丰度的最大允许限度范围内，因此可判定该样品为阳性样品。

2.18 定量限测定 根据《中国药典》2020年版四部0212 药材和饮片检定通则规定，中药材及中药饮片的药屑及杂质通常不得过3%。按照小儿咳喘灵颗粒制备工艺制备出掺入3%山银花的阳性样品，HPLC-ELSD法检测出灰毡毛忍冬皂苷乙的含量为0.23 mg/g，信噪比为10；根据LC-MS/MS法检测出3%山银花的阳性样品灰毡毛忍冬皂苷乙的含量为0.20 mg/g，通过色谱计算定量离子及定性离子的信噪比分别为420.0、38.0、21.0、25.0，大于10，满足仪器定量限要求，故将此方法的定量限设置为0.20 mg/g。

3 结果与讨论

3.1 目标成分的选择 根据文献记载，灰毡毛忍冬皂苷乙及川续断皂苷乙是区分山银花及金银花的专属性化学成分[4-6]。经前期研究发现，按照小儿咳喘灵颗粒生产工艺制备的含山银花阳性样品，经前处理提取后无法在HPLC-ELSD法中得到较好的呈现。此外，现行药典中含山银花类制剂的山银花检查均选用灰毡毛忍冬皂苷乙为特征性成分[7-10]，故本研究选择山银花的主要特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙作为目标成分进行测定。

3.2 样品提取条件的选择 本研究考察了小儿咳喘灵颗粒的不同提取方式(超声法、回流法、浸提法)，比较了不同提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、正丁醇)的提取效果，发现50%甲醇为提取溶剂的超声提取方法简单，成分含量最高、提取效果最好，并对超声提取时间(15 min、30 min、45 min、60 min)进行了比较，超声提取30 min、45 min、60 min时，灰毡毛忍冬皂苷乙的的含量差距较小，故选择超声提取30 min。

3.3 色谱条件的优化 灰毡毛忍冬皂苷乙无明显紫外吸收，故采用蒸发光散射检测器进行测定。在HPLC-ELSD法中考察过乙腈-水的等度洗脱，发现目标峰与杂质峰的分离效果不好，故采用梯度洗脱方式；同时考察乙腈-0.1%磷酸为流动相，发现色谱峰与乙腈-水为流动相洗脱时相比较差异不明显，故选择乙腈-水为流动相。

LC-MS/MS法中乙腈-0.1%甲酸为流动相的等度洗脱就能达到很好的分离效果，故采用等度洗脱方式。当采用乙腈-水为流动相洗脱时，色谱峰的峰型不如乙腈-0.1%甲酸为流动相的峰型，故采用乙腈-0.1%甲酸为流动相。

3.4 样品含量测定结果分析 10家生产企业的10批小儿咳喘灵粒中，有1批少量检出灰毡毛忍冬皂苷乙，但未超过本研究拟定的定量限。可能该企业采购的金银花混有少量山银花，存在潜在风险。

综上，本研究建立的HPLC-ELSD法可准确检出小儿咳喘灵颗粒中含有的灰毡毛忍冬皂苷乙，并与LC-MS/MS法的验证结果一致。本方法专属性强，结果准确可靠，重现性好，可以有效控制小儿咳喘灵颗粒中金银花投料的情况。采用伪品投料的情况有可能影响产品的有效性和安全性，建议增加小儿咳喘灵颗粒补充检验方法，增加山银花检查项目，以杜绝部分厂家以山银花投料的违规行为，为药品监管提供技术支撑。