β-烟酰胺单核苷酸的功能和化学制备进程

齐勇，姚崇虎，沙云冲，陈森林

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽 马鞍山 243100）

NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）在人类健康中扮演着至关重要的角色，它可以促进上千种生物活性的发挥，但是，当我们年纪越大，体内其含量也会越低。NMN（β-烟酰胺单核苷酸）是体内烟酰胺核糖转变为NAD+路径最重要的中间体。近年来，NMN 的研究取得了重大进展，发现它具有多种生物学功能，可以有效地治疗心脑血管、老年痴呆、神经衰弱以及延缓衰老[1]等多种慢性疾病。最新的研究发现，NMN 能有效延长30%以上的生物模型体系的寿命[2]。同时研究还表明，NMN 可能和衰老有关，这一发现引起了社会对“不老神药”NMN 的广泛关注，在保健品和食品行业中引发了激烈的讨论，但NMN 的抗衰老成效和机制尚未完善，存在争议。随着NMN 的快速发展，目前的国内市场容量已经超过10 吨，未来有望实现百吨级的规模。2010 年之前，NMN 的生产是通过化学方法完成的，由于技术路线的局限性，使得NMN 的价格一直保持在30 000 元/kg 以上，这严重阻碍了它的功能验证和普及应用。近年来随着NMN 代谢途径的深入探索和酶工程技术的不断改善，一步酶法在NR 合成NMN 方面取得了巨大突破，使其成为NMN 生产的首选方式，并且在实现大规模工业化之后，NMN 的生产成本将会降到10 000元/kg或更低，而且，如果NR合成的成本能够得到进一步的降低，NMN 的生产价格将会达到五千元或更少。NMN 的生产正在朝着一个新的方向发展，其成本可能会大幅降低。

1 NMN在与年龄有关的疾病中的研究进程

NMN被认为是一个重要的NAD+中间体，它通过动物实验得到了可靠的结果：通过静脉注射，NMN可以显著增加包括大脑在内的多个外围器官的NAD+浓度；通过腹腔注射NMN，可以显著改善海马区和下丘脑的NAD+水平；而且，研究表明，长期口服NMN能够显著改善与年龄成正比的个体组织的NAD+水平。NMN 的应用显示出NAD+中间体具有强大的抗衰老功能，可以用于预防和治疗各种衰老症状。

1.1 糖尿病

研究发现糖尿病患者大脑中NAD+水平明显降低。Yoshino 等[3]建立的糖尿病小鼠模型以及挑选自发形成的糖尿病小鼠来进行研究，实验结果表明，NMN改善了年龄诱导的DM 小鼠及饮食诱导的小鼠存在的的葡萄糖不耐受和脂质谱问题，并且整个研究过程中非糖尿病小鼠的葡萄糖稳态没有受到影响。Revollo 等[4]的研究结果也同样证明了小鼠糖耐量及胰岛素分泌可以通过补充NMN 来改善。经过Chandrasekaran 和其他人的研究，利用STz 技术构建的糖尿病大鼠模型，也显示出NMN的补充能够有效提高小鼠的糖耐量和胰岛素的分泌水平，即NMN对糖尿病的治疗理论上存在效果。

1.2 肥胖

实验证明，NMN 可以以剂量依赖性的方式来减少与年龄相关的体重增加。肥胖与糖尿病之间有着密切的联系，肥胖会影响线粒体的功能，从而导致胰岛素抵抗和2型糖尿病。NMN的应用可以有效缓解这种情况，从而达到减轻体重的目的。

1.3 阿尔茨海默病（AD）

衰老是造成老年痴呆的一种严重的危险因素，其中线粒体功能障碍是其中最常见的原因。研究发现，NMN 可以改善老年性疾病的线粒体功能，从而有效预防老年痴呆的发生。目前有研究人员凭借此理论研发相关药物，期望能够改善老年人的健康状况。同时，目前它被认为没有副作用，可以放心使用。

1.4 脑出血

ICH（脑出血）是一种危及生命的疾病，其发生率和致命率均极高，而幸存者也会遭受严重的神经功能损害。ICH的破坏过程可以划分为两个阶段：一个是血肿的形成，它会给周围的组织带来机械性的破坏；另一个则是血肿导致的病理学改变，从而导致新的损害。研究结果指出，当ICH发作1 h后，通过尾静脉注射NMN，虽然小鼠的出血量和血肿体积无明显变化，但发现NMN可以促进神经功能的恢复，并且还可以有效地缓解脑水肿、炎症因子、体重以及细胞凋亡等问题。此外，NMN还被证实具备良好的抗凝活性，从而可以促进胶原酶诱导的脑出血模型的建立[5]。

2 NMN的合成进展

2.1 产品举例

NMN 具有强大的生物活性，因此在市场上出现了许多以NMN 为原料的产品。这些产品的主要目的是抗衰老和保健。在美国、加拿大、西班牙、日本和德国等国家，都有专门生产含NMN 的产品，其中的纯度、规格和价格存在一定差异。随着规格的增加，纯度也会提升，从而使价格也相应上涨。一般来说，每瓶六十粒，每粒130～400 mg，人民币售价约为800～3 000元。

2.2 常用化学合成路线

NMN的化学合成研究起始较早，主要以烟酰胺、三苯甲酰基-β-D-核糖、四乙酰核糖等为原料，通过糖基化、磷酸化、氨解等关键步骤合成。根据起始原料和保护基团的不同，主要合成路线有六条，都具有显著的优势和劣势，具体情况如下。

1981 年首次报道的以三苯甲酰基-β-D-核糖为原料的合成途径步骤短，收益高，但污染大，原料不容易获得，收率较低，难以大规模应用；1984 年首次报道的以Amp 为原料的合成途径原材料易得，但反应苛刻，存在手性分离困难的问题，无法实现大规模应用；1999年首次报道的以四乙酰核糖为原料的合成途径步骤短，原材料易得，价格低，但具有化学污染；2002 年首次报道的以四乙酰核糖和烟酰胺为原料的合成途径步骤较短，原材料容易获得，易放大，具有较高的收率、工业放大容易等优点，但具有化学污染、异构体拆分困难、无法实现大规模应用等缺点；2004年首次报道的以烟酰胺为原料的合成途径步骤短，每步收率高，但原料昂贵，分离相对困难，成本相对较高；2018 年首次报道的以烟酸乙酯和四乙酰核糖为原料的合成途径步骤简短，原材料易得，易放大，收率高，工业放大容易，但会造成化学污染，试剂成本高，纯化成本高[6]。代表性的合成方法都是以四酰基β-D-核糖为起始原料的方法，具体分析如下：

2.3 前两种合成路线

方法1：

方法2：

这两条合成路线都是通过脱去四乙酰β-D-核糖中的1 位OAc 基团，生成三氟甲磺酸基β- 烟酰胺核糖中间体，由于1 位OAc 基团不易脱去，需要用昂贵的TMSOTf 活化四乙酰核糖中的1 位OAc，使其更容易离去，另外，得到的三氟甲磺酸基β-烟酰胺核糖中间体极性较大，分离纯化比较难，需要通过活性炭色谱分离，因此收率较低，工艺放大难。

2.4 第三条合成路线

第一步是将四酰基-β-D-核糖与乙酰氯+甲醇或易制毒气体氯化氢反应，制1-氯-2，3，5-三酰基-β-D-核糖，首先这步会得到1-氯-2，3，5-三酰基-β-D-核糖和1-氯-2，3，5-三酰基-α-D-核糖的混合物，这两个非对映异构体一同参与后面的氨解反应和脱保护反应，得到β-烟酰胺核糖和α-烟酰胺核糖的混合物，然后经有机溶剂浆洗以除去α-烟酰胺核糖杂质。由于β-烟酰胺核糖和α-烟酰胺核糖为非对映异构体，通过有机溶剂浆洗的方法很难完全除去α-烟酰胺核糖杂质，该杂质会参与后面的磷酸化反应，导致产生目标产物NMN 的异构体α-烟酰胺单核苷酸，这个异构体与目标产物NMN 也为非对映异构体，很难分离，影响了目标产物NMN 的质量。其次，由于1 位OAc 基团不易被取代，且在盐酸体系中分子中的保护基R 容易部分脱去，因此，需用大过量（10个当量以上）酰氯在低温（-25～-20℃）下反应。另外工艺的第二步以昂贵的TMSOTf 为催化剂，生成三氟甲磺酸基β-烟酰胺三乙酰核糖，再脱去三酰基后也得到难以分离纯化的三氟甲磺酸基β-烟酰胺核糖；脱保护中需用甲醇钠等强碱在较低温度（-5℃）、较长时间（24 h）等条件下才能脱去三个酰基。因此，这个方法不仅收率低，操作繁琐，产品质量也难以保证[7]。

3 生物合成路线

NMN的生物合成包括发酵法和酶法。发酵法由于自身原因，生产效率较低，不利于工业化生产。2018年，一种基于NMN 代谢相关酶的基因工程大肠杆菌发酵制备NMN，其产量达到15.42 mg/L[8]，这一成果提高了NMN 的生物合成效率，有助于工业化生产。相比传统的发酵法，这种方法具有更高的效率，可以更有效地利用菌体本身的资源，从而实现大规模生产[8]。在2020年，一项研究即利用大肠杆菌设计了一种新的生物合成途径来合成NMN，具有显著的优点，即不需要其他的辅助因子，但是获得的NMN的产量非常低，只有1.5 mmol/L[9]（0.5 g/L），没有太多的工业价值。但在2020年底，成功地构建了一种基因工程重组大肠杆菌，它能够摄取葡萄糖和烟酰胺，其中包括NiaP、PunC和NAMPT酶，最终可以使NMN 产量达到6.79 g/L[10]，这是目前发酵法制备NMN报道中最高的产量。下面是对几种生物制备方法的具体分析：

3.1 发酵法

国内外科研人员对发酵法合成NMN 也进行了大量的研究。发酵法过程比较复杂，因为它包含了多种酶的复杂系统。除了反应条件外，催化过程还可能受到其他非目标酶的影响。发酵法利用NAMPT 催化PRPP 转化为NMN，其中的焦磷酸盐（PPi）是一种副产品。Burgos 等［11］证明，PPi 的水解有利于反应平衡向NMN 的生产方向转移。通过添加焦磷酸酶（PPase）消除PPi，NMN的产量增加了约50%，可能是因为副产品PPi的降解促进了反应过程［12］。但由于宿主细胞内其余非目标酶的存在，在催化过程中可能会发生底物、中间产物和NMN合成的最终产物的消除。在发酵法中，有研究表明细胞内的底物转入和产物转出是影响NMN产量的另一个关键因素［13］，NAM 进入到工程菌细胞内是合成NMN 所必需的首要条件。在筛选的6个烟酸转运基因（NiaP）中，来自布氏菌的NiaP表现出对NAM最高的吸收活性。在表达NiaP 的基因工程菌中，NMN 的产量提高约25%。NMN在细胞中会通过NMNAT催化作用转化为NAD，从而导致其产量下降。因此除了下调NMNAT 外，避免这种转化的另一个策略是将NMN 输出到细胞外。而PRPP 和NAM 向NMN 的转化是可逆的，这就表明NMN在细胞内的积累可能会阻碍产品在细胞内的形成。

3.2 D-5-磷酸核糖和烟酰胺作为原料

以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为原料，在ATP 存在下，在磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPPs）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的催化下，制备β-烟酰胺单核苷酸，如专利CN 2018109407295 公开了这种方法，底物的转化率可达86.9%～89.8%。又如WO 2018/023206 公开了以烟酰胺和5′-磷酸核糖基-1′-焦磷酸（PRPP）为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体（F180A）的催化作用下制备NMN，底物烟酰胺转化率可达66%。

3.3 烟酰胺核糖（NR）作为原料

以烟酰胺核糖（NR）为起始原料，在烟酰胺核糖核苷激酶（Nicotinamide Ribonucleoside Kinase，NrK）和ATP 的作用下，一步反应得到NMN，收率高，产品纯度高。其中专利CN 2016112456194，以烟酰胺核糖（NR）为底物，在ATP 等磷酸供体存在下，在来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的烟酰胺核糖激酶的催化下反应24 h生成β-烟酰胺单核苷酸，纯化后β-烟酰胺单核苷酸纯度大于95%。

4 展望

鉴于NMN 具有抗衰老等功能以及具备安全性较高、热稳定性较好等优点，同时NMN在延缓衰老方面具有一定的功效，其中对于帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病、肥胖等疾病的治疗效果较优［14］。由于目前NMN 的合成仍然艰难，其面临操作复杂、产品纯度低、收率低以及成本高昂等问题。在今后的研究中，可利用基因工程技术，采用全细胞生物催化方法合成NMN，最终构建出一个完整、高效的β-烟酰胺单核苷酸全细胞催化和分离纯化体系，为NMN 的产业化奠定基础。现今我国在医疗健康方面应用NMN 的占比较大，而在食品方面的应用却寥寥无几。随着业内对NMN安全性及效果的进一步探索研究，将会有更多与NMN 相关的保健品用于生活中，造福人类。