体外培育牛黄配伍冰片激活PI3K/Akt通路抑制脑缺血再灌注模型大鼠神经元凋亡*

陈 海, 任敉宏, 郭晓庆, 李 勇, 李红燕, 马 荣, 谢 倩, 王 建△

1成都中医药大学药学院,西南特色中药资源国家重点实验室,中药材标准化教育部重点实验室,成都 611137 2长治医学院药学院,长治 046000 3北京瑞诺众德科技有限公司,北京 100089

牛黄与冰片均具有“开窍醒神”功效,中医临床中常配伍使用治疗中风,且疗效明确。清代蒋介繁《本草择要纲目》:“凡中风入脏者,必用牛雄脑麝之剂,入骨髓、透肌肤、以引风出”,其中牛为牛黄,脑为龙脑(即冰片)。

查阅文献发现目前牛黄配伍冰片改善脑缺血再灌注(CIRI)的基础研究鲜见,课题组前期研究证明了牛黄与冰片配伍对脑缺血再灌注模型大鼠的脑保护作用,并基于血管新生探讨了其可能的机制,结果发现药物干预后缺血侧皮层区神经元及新生血管密度显著高于溶剂模型组[1]。由于CIRI会导致神经组织损伤,主要表现为神经元的凋亡[2-3],而中药具有多成分、多靶点的特点,故作出“牛黄配伍冰片能抑制CIRI后神经元凋亡”的推断。磷酯酰激醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路是细胞重要的存活通路之一,与细胞凋亡关系密切[4-5]。故本文以PI3K/Akt信号通路为切入点,探讨牛黄配伍冰片的脑保护作用是否与抑制脑缺血再灌注后神经元凋亡有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠,体重250～270 g,8～10周龄,由北京斯贝福生物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK(京)2019-0010,动物质量合格证号:No.110324200103134075。实验动物饲养于成都中医药大学实验动物中心(室内温度控制在23～27 ℃,相对湿度50%左右,且通风良好,饲料、饮水自由)。本研究涉及的动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准,批准号TCM-2016-312。

1.2 药物与试剂

本研究中牛黄使用体外培育牛黄,购于武汉天鹏医药有限公司;三种商品冰片中选择使用艾片,购于贵州罗甸艾纳香药业有限公司。尼莫地平片(亚宝药业集团股份有限公司,批号190312);注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂,批号17121209-2);水合氯醛、吐温80(成都市科隆化学品有限公司,批号:2018103001、2019070301);兔抗p-PI3K、PI3K抗体(Abcam,批号:ab182651、ab191606);兔抗p-Akt、Akt抗体(Cell signaling technology,批号:S473、C67E7);兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2抗体(GeneTex,批号:GTX110543、GTX109683、GTX100064);兔抗GAPDH抗体(Affinity,AF7021);Trizol Reagent(北京雷根生物技术有限公司,批号:NR002)。Tunel Cell Apoptosis Detection Kit(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号:G1507)。

1.3 药物剂量

参照课题组前期研究的计算方法[6],体外培育牛黄的高、中、低剂量分别为0.20、0.10、0.05 g/kg。阳性对照药物选用尼莫地平,剂量为0.012 g/kg。

1.4 主要仪器

全自动轮转式石蜡切片机(LEICA,RM2255);奥林巴斯光学显微镜(OLYMPUS BX43,济南千司生物科技有限公司);高速组织研磨仪(赛维尔,型号KZ-Ⅱ);电泳仪、荧光定量PCR仪(BIO-RAD,型号:1658033、CFX connect);免染型化学发光凝胶成像系统(BIO-RAD,ChemiDoc);微量分光光度计(NanoPhotometer N50 Touch)。

1.5 动物分组及造模方法

1.5.1 动物分组 SPF级雄性SD大鼠52只,适应性喂养3 d,随机分为假手术组,模型组,溶剂模型组,尼莫地平(0.012 g/kg)组,体外培育牛黄0.20、0.10、0.05 g/kg组,艾片0.20、0.10、0.05 g/kg组,配伍0.40、0.20、0.10 g/kg组,共13组,每组4只。每天定时称重并按10 mL/kg体积灌胃,假手术组和模型组给予生理盐水,溶剂模型组给予2%吐温-80溶液。预防性给药第3天灌胃30 min后,改良线栓法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,缺血90 min后再灌注,造模成功后,继续灌胃给药3 d,末次灌胃给药30 min后,脱颈处死大鼠取材。

1.5.2 模型制备 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,翻正反射消失后,将其仰卧于手术台,四肢固定。采用改良线栓法制备MCAO模型:颈部正中切口,将线栓沿左侧颈总动脉向颈内动脉插入20 mm,穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉(ACA)近端,缺血90 min后抽出线栓,缝合伤口。大鼠苏醒后Longa评分≥1分为造模成功。假手术组仅进行皮肤切开和血管分离操作,不做线栓处理,剩余操作同其他组。

1.6 苏木精-伊红(HE)染色

取模型大鼠缺血侧皮层及海马区脑组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,HE染色。光镜下(×40,×200)观察各组大脑皮层的损伤情况,并按以下方法进行半定量比较:无病变,计0分,病变面积小于10%计1分,面积为10%～计2分,30%～计3分,大于50%计4分。使用Image J软件对200倍镜下海马CA1区正常神经元进行计数。

1.7 Tunel染色观察皮层神经元凋亡

石蜡切片,按Tunel染色试剂盒步骤操作,拍照后400倍光镜下使用Image ProPlus 6.0软件对染色阳性细胞进行计数。凋亡指数=视野内凋亡的神经元数/视野内所有神经元数×100%。

1.8 qRT-PCR检测相关蛋白mRNA表达

取缺血侧皮层脑组织50 mg,Trizol法提取总RNA,反转录合成cDNA。美国生物技术信息中心(NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载大鼠PI3K、Akt、Capase-3、Bax、Bcl-2基因全序列,使用引物软件(Primer Premier)设计和筛选引物,引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,各引物序列如表1所示。荧光定量PCR反应条件:95 ℃,2 min预变性;95 ℃变性10 s,55 ℃退火延伸30 s,进行40个循环。用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

表1 引物序列信息

1.9 Western blot法检测PI3K/Akt通路相关蛋白的表达

取缺血侧皮层脑组织50 mg提取总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度。用PBS及5×Loading buffer稀释蛋白样品,SDS-PAGE电泳后,转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。使用5%脱脂奶粉封闭2 h,4 ℃下一抗孵育过夜。TBST洗涤后,孵育二抗,最后使用增强化学发光试剂在ChemiDoc成像系统显影成像。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 对皮层及海马区脑组织病理的影响

光镜40倍和200倍视野下,观察对脑缺血再灌注模型大鼠海马、皮层区的影响,并对皮层区的损伤及海马CA1区正常神经元计数进行半定量分析。由图1可见,与假手术组比较,模型组、溶剂模型组的脑皮层损伤评分显著增加,神经元计数显著减少(均P<0.01)。与溶剂模型组相比,牛黄3个剂量组,艾片0.20 g/kg组,配伍3个剂量组的皮层损伤得分均显著降低,海马CA1区神经元计数显著增加(P<0.01或P<0.05)。配伍0.10 g/kg组海马CA1区神经元计数有高于牛黄0.05 g/kg组的趋势。

与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;与溶剂模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;n=4

综合前期研究药效学及血管新生相关指标结果[1],选取牛黄0.20 g/kg组(以下简称牛黄组)、艾片0.20 g/kg组(以下简称艾片组)及配伍0.40 g/kg组(以下简称配伍组)进行机制探讨。

2.2 对皮层神经元凋亡的影响

将MCAO模型大鼠缺血侧大脑皮层组织进行Tunel染色,光镜(×100,×400)观察其染色结果,如图2所示。与假手术组相比,溶剂模型组大鼠皮层神经元凋亡指数显著升高(P<0.01)。与溶剂模型组比较,牛黄组、配伍组皮层神经元凋亡指数显著降低(均P<0.01)。

1:假手术组;2:溶剂模型组;3:艾片组;4:牛黄组;5:配伍组;红色箭头所指的为凋亡细胞;与溶剂模型组比较,##P<0.01;n=3

2.3 对PI3K/Akt通路相关蛋白mRNA表达的影响

采用qRT-PCR技术检测缺血侧脑组织中PI3K/Akt通路相关蛋白mRNA的表达。

与假手术组比较,溶剂模型组缺血侧脑组织中PI3K、Akt、Bcl-2 mRNA表达显著降低,Caspase-3、Bax mRNA表达以及Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.05或P<0.01)。与溶剂模型组比较,牛黄、艾片及其配伍组均能显著降低Caspase-3、Bax mRNA表达;配伍组Akt、Bcl-2 mRNA表达显著升高,Bax/Bcl-2比值显著降低,且配伍组这一效果显著优于牛黄组(P<0.01)。见图3。

1:假手术组;2:溶剂模型组;3:艾片组;4:牛黄组;5:配伍组;与溶剂模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;与牛黄组比较,&&P<0.01

2.4 对PI3K/Akt通路蛋白表达的影响

Western blot检测PI3K/Akt通路p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2的蛋白表达,并计算Bax/Bcl-2比值,结果如图4所示。与假手术组比较,溶剂模型组缺血侧脑组织中p-PI3K、p-Akt及Bcl-2蛋白表达显著降低,Caspase-3、Bax蛋白表达以及Bax/Bcl-2比值显著升高(均P<0.01)。与溶剂模型组比较,牛黄、艾片及配伍组均能显著升高p-PI3K及p-Akt蛋白表达,显著降低Caspase-3、Bax蛋白表达,降低Bax/Bcl-2比值,配伍组能显著升高Bcl-2蛋白表达;在升高p-Akt及Bcl-2蛋白与降低Caspase-3蛋白表达方面,配伍组明显优于牛黄组(P<0.05或P<0.01)。

1:假手术组;2:溶剂模型组;3:艾片组;4:牛黄组;5:配伍组;A:相关蛋白电泳图;B～F:p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平半定量;G:Bax/Bcl-2比值;与溶剂模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;与牛黄组比较,&P<0.05,&&P<0.01

3 讨论

PI3K/Akt信号通路与细胞凋亡关系密切,PI3K活化后,可磷酸化下游的Akt,Akt活化后可促进细胞生存及抑制凋亡:Akt可通过磷酸化mTOR的负调控因子,从而促进mTOR的活化,促进细胞生存;Akt可磷酸化Caspase-9后减弱Caspase-9的活性,抑制由于Caspase-9活化而引起的级联反应;Akt可直接磷酸化Bcl-2家族蛋白BAD,使BAD不能与Bcl-2和Bcl-X结合,从而抑制BAD诱导的细胞凋亡;Akt还能磷酸化糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以抑制其活性,对细胞内的能量进行代谢调节,从而抑制凋亡[4-5];此外,Akt还可磷酸化多种转录因子,以抑制细胞凋亡,促进细胞的生存:①直接磷酸化Forkhead家族转录因子。Forkhead家族转录因子与细胞生存关系密切,磷酸化的Forkhead可以通过其靶基因而促进细胞生存[6];②与MDM2结合并磷酸化MDM2,使p53降解或失活,抑制p53诱导的细胞凋亡[7];③直接或间接调节NF-κB激酶活性,使NF-κB转移至细胞核并提高其活性,促进NF-κB依赖的生存相关基因的转录和表达,从而促进细胞生存[7];④磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)和YES相关蛋白(YAP),增加它们的转录活性以抑制凋亡。PI3K/Akt信号通路与凋亡的关系如图5所示。

图5 PI3K/Akt信号通路与凋亡的关系

PI3K/Akt信号通路激活后,还可作用于NF-κB、mTOR、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、一氧化氮合成酶(NOS)等下游靶点以发挥抗凋亡作用。①作用于下游靶点NF-κB:研究发现CXCL8基因沉默可通过调节PI3K/Akt下游的NF-κB,抑制神经胶质细胞损失和凋亡指数[8];大黄素可抑制人第10号染色体上PTEN基因的表达,激活PI3K/Akt通路,降低NF-κB p50核蛋白转录水平,从而抑制神经细胞凋亡[9];益髓解毒法可激活PI3K/Akt信号通路,通过使大鼠海马组织内NF-κB蛋白和基因表达上调、使Caspase-3、Caspase-9以及BAD蛋白和基因表达下调,从而发挥抗凋亡作用[10]。②作用于下游靶点mTOR:曲美汀酸B在体内和体外的脑缺血模型中均可通过抑制微小RNA-10a(miRNA-10a)表达,激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而减少线粒体介导的细胞凋亡[11]。③作用于下游靶点GSK-3β:激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,可降低促凋亡蛋白Bax的表达,升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,以发挥抗凋亡作用[12-13]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理可激活PI3K/Akt信号通路,通过调控GSK-3β进而影响Wnt/β-catenin信号通路,从而发挥抗凋亡作用[14]。④作用于下游靶点NOS:鞣花酸可激活PI3K/Akt信号通路,作用于下游的NOS,降低大鼠缺血侧脑组织促凋亡相关蛋白(Bax、CytoC、Caspase-3)的水平而具有抗凋亡作用[15]。

另外,激活PI3K/Akt通路,还可以减轻ERS及抑制线粒体介导的凋亡通路以发挥抗凋亡作用。激活PI3K/Akt通路,可显著逆转神经元损伤和ERS的细胞凋亡[16-17];激活PI3K/Akt通路,可上调脑组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达和升高Bcl-2/Bax比值,下调促凋亡蛋白Bax、CytoC、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达以发挥抗凋亡作用[18]。

本实验研究结果显示,体外培育牛黄、艾片及两药配伍后显著减轻缺血侧脑组织病理损伤、减轻缺血侧皮层神经元凋亡;可显著上调p-PI3K及p-Akt蛋白,下调Bax、Caspase-3蛋白,降低Bax/Bcl-2比值,表明PI3K/Akt信号通路被激活,体外培育牛黄、艾片及两药配伍调控MCAO模型大鼠的机制可能与激活PI3K/Akt通路、抑制凋亡有关。体外培育牛黄及配伍组均可上调p-Akt、Bcl-2表达,下调Caspase-3表达、降低Bax/Bcl-2比值,且配伍组显著优于牛黄组,一定程度上体现了“相使”增效的配伍关系。

本研究首次以体外培育牛黄配伍冰片为研究对象,以脑缺血再灌注模型大鼠为载体,阐释了体外培育牛黄、冰片及二者配伍通过激活PI3K/Akt通路抗神经元凋亡而发挥脑保护作用,可能是其表现出“开窍醒神”功效的分子生物学基础。然而中药具有多成分多靶点的特点,其是否还与抗炎以及神经发生有关,对脑缺血后期是否具有保护作用等,均有待今后更深入研究。