一例安格斯肉牛巴贝斯虫病的诊断与治疗

刘秀娟，张梅梅

（准格尔旗农牧局，内蒙古 鄂尔多斯 010300）

1 前言

1.1 病原

寄生虫病对全球公共卫生有着深远影响。据世界卫生组织2020 年全球卫生统计报告，传染病和寄生虫病是导致动物死亡的主要原因之一[1]。目前寄生虫主要分为体内寄生虫和体外寄生虫，而体外寄生虫也是动物最易感的原虫之一[2]。巴贝斯虫病是一种全球性的人畜共患病，对人和动物的健康及养殖经济效益有重大影响[3]。该寄生虫主要寄生在生物的红细胞内，并且有高度的宿主特异性。迄今为止，已鉴定出100多类不同的物种均可被感染，并且这种寄生虫的宿主有向人类发展的趋势。有报道称，英国有一例患者因感染该寄生虫导致死亡[4]。研究表明，在过去20～30 年中，该寄生虫感染牛的病例越来越多，且成为制约肉牛养殖业发展的一个主要原因[5]。

巴贝斯虫体多为环形、梨形等，主要寄生在红细胞中，会侵袭宿主血液循环系统，因而巴贝斯虫病成为肉牛养殖中一个值得关注的问题。该疾病虽然死亡率较低，但会造成动物慢性消耗，使肉牛逐渐消瘦，养殖成本不断增加[6]。受感染的牛会出现发热、厌食、血红蛋白尿（俗称“红水”）及贫血等症状，少数病例还会出现神经症状和死亡现象[7]。

目前巴贝斯虫的主要传播媒介为硬蜱，该寄生虫寄生于硬蜱体内，硬蜱再寄生于其他动物体表通过吸血将巴贝斯虫卵传播到宿主血液中，使宿主感染巴贝斯虫。怀孕的母畜感染该寄生虫后还会经卵巢垂直传播给胎儿，造成胎儿感染[8]。垂直传播这一现象增加了人类对巴贝斯虫病的控制难度，因为即使通过治疗将巴贝斯虫从宿主身上清除，但药物无法通过胎盘屏障进入宿主胎儿体内，使得胎儿感染后无法治愈[9]。

1.2 诊断方法

目前，确定巴贝斯虫感染的手段包括显微镜观察。可将待检血液制成血涂片，然后对染色的血液涂片进行显微镜检查，观察红细胞内是否含有梨状体样的寄生虫。ELISA 试验也可对巴贝斯虫进行检测鉴定[10]。此外，寄生虫体中的18S 小亚单位（SSU）核糖体RNA 基因的PCR 扩增和测序技术也是一种用于寄生虫检测和物种鉴定的高灵敏度分子生物学方法[11]。该基因位于梨形体发育信息可变区，许多已发表的序列均有助于进行物种分类[12]。PCR 技术被证实比血清学检测更灵敏，比起仅可提供被检动物先前是否被病原感染的抗体反应，PCR 技术还可以直接检测带病动物体内的病原体[13]。

在英国，传统上侧重于确定风险地理区域后进行放牧管理，然后将小牛引入这些风险区域，以增强免疫力，从而促进当地地方病的稳定性[14]。这种方法依赖于公认的“牛巴贝斯虫病反年龄抗性现象”，即1 岁以下的小牛对该病表现出自然(先天性)免疫[15]，感染的特点往往是低水平的寄生虫血症，可以持续很长时间。目前，英国牛的巴贝斯虫病主要根据临床症状以及农场和动物发病史进行诊断[16]。

2 病例诊断情况

2.1 病史调查

2022 年9 月，在内蒙古鄂尔多斯市准格尔旗某规模化大型肉牛养殖场，兽医人员例行巡查牛只状态时发现某圈舍有14 头牛精神沉郁、厌食且触诊体温较高。截至发病前，该场肉牛存栏量为450 头，其中患病牛14 头，发病率为3.11%。该养殖场有1 栋隔离圈舍，5栋饲养圈舍，配备有自动饲养设备及清粪设备。圈舍整体干净整洁，之前未出现过有相关症状的病例。

2.2 临床症状

患病牛为进口安格斯肉牛，体温均高于40.2 ℃，对外界刺激较为不敏感，仔细观察体表发现有蜱虫附着。经过临床症状观察疑似肉牛感染血液寄生虫病，具体发病原因需要对血液进行详细的实验室检测。

2.3 实验室诊断

将患病牛只进行隔离饲养，颈静脉采血2 mL，依次标记为1～14 号并将血样送至实验室进行处理及检测。

2.3.1 血涂片检测。在采集的14 管患病牛的血液样品中加入0.2 mL 抗凝剂。分别吸取10 μL 抗凝血滴加到载玻片上，用另一块载玻片从一边轻轻地匀速推到另一边，使血液均匀地覆盖在载玻片上并在室温下晾干。在晾干的血液涂片上滴加2 滴甲醇溶液进行固定，接着在血涂片上滴加100 μL 吉姆萨染色A 液静置20 min，用等量pH 值为7.2 的磷酸盐缓冲B 液与吉姆萨染色A 液混合静置20 min 后用蒸馏水冲洗，再用滤纸吸干血涂片，置于光学显微镜上；滴加1 滴香柏油后用1 000×油镜观察血涂片。

由图1 镜下观察到，红细胞呈现不规则形状，胞内有多个环形、梨形等形状不一的虫体，单一的虫体整体长度约为红细胞半径的四分之一，多数位于红细胞边缘，有的红细胞中有3 个以上的虫体。血涂片镜检疑似牛巴贝斯虫病，但具体的诊断还需进一步检测。

图1 血涂片镜检

2.3.2 ELISA 检测。用抗凝血分离后的血浆进行牛巴贝斯虫ELISA 检测。吸取每个待测样品中10 μL 血浆到酶标检测板孔中，同时加设阴性、阳性及空白对照（每个对照设2 个重复防止出现误差）封板，37 ℃放置20 min； 弃去废液用PBS 洗涤3～5 次，再加入100 μL HRP 酶标抗体封板，37 ℃放置20 min；再弃去废液用PBS 洗涤3～5 次，加入反应液（A 液、B液各50 μL）于37 ℃放置15 min；最后加入50 μL终止液 （需在10 min 内检测），置于酶标仪内在OD420进行检测。

结果如表1 所示，本次检测值均大于阈值，显示存在牛巴贝斯虫抗体，为了进一步确诊，需进行PCR试验。

表1 牛巴贝斯虫ELISA 检测结果

2.3.3 18S rDNA PCR 检测。提取待检牛血浆中巴贝斯虫的DNA，用特异性引物（表2）[15]进行18S rDNA的PCR 鉴定。反应条件为：94 ℃3 min；94 ℃30 s，56 ℃20 s，71 ℃30 s，30 个循环；73 ℃5 min[13]。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果（图2）。

表2 牛巴贝斯虫特异性引物序列表

图2 18S rDNA PCR 扩增结果

将PCR 产物送至生物公司测序，测序完整序列结果如下所示。结果在NCBI 数据库进行比对后，显示与牛巴贝斯虫同源性为99.9%，证明本例病因是牛巴贝斯虫感染。

测序完整序列：atggaggctacaacaactgcaaaaacagggatatggaaaaaatatctcactttg gtggttcctatactatgtgtag tgattctttctggtgaagtggtacccacagaagc tgccttccaatacgtgaaaatgagccaaagcgcag aaccagccgtagagatg gtggaaggtcctcaaggagacaa actaccaactctcggttgtcagcggatatg atgacagtgacgatggtgatgattccg ataggcccagaggaaggcaacagtc ctccaaatctacgccgaaggat atctggggcagatacatgccaagtttgacctt gcgaaatcccacggttccggtatatacgtcgacctaggagggacagaaaggg ttggtgccacgcaacatcgtatgcccaccggtaagtgccccgtatgggtaagg tgattaacttgggaaacaatgcggacttcctcaaccgaatatccgccgaaaccc acaggacagaggtctggcatttcctgatacagcagttgcagtaactagaaatag caacgcaaggaatcgtgcggcggccgagaaaactgagattattctatcgcctg tgtccgcagcagaccttgtacggtggggctacgatggcaacgacgtcgccaa ctgcgccgagtatgccggcaatatcatacctgcttctgac acagcgcaaa gta caggtacccttgcgtatacgatgccaaggaggaaatgtgtcacatcct cttcac gcccatgcagtacaaccgaggtagtagatatt gtgacaatgatggatcccaag acgaggggacaagctccctcctgtgtatggagccgatgaagagcggcattga tgcacacctttactacggttcttcacgggtagataaaaaatgggaagaaaactg tcccatgtacccagttaaggatgctatctttgggaggggggccaattggacttgt tgtcgctattgagtccgctttcgaagaatttcacgcgtgacgcagaggagtgttc tgctcttatgttcgaaaacgcagcagctgatctcgaaatcgatgaggaagctga taacttcgatgaactgaagactc tatccgacggccttcggaacataaaggcctc caagattgctcaagcgctattctccccaatcgcgaaagcaggcacctcggcca aaaattccaagggagtaggaatgaactgggctaaactatgacagcaatactgg attgtgccgtgttatagaagaaactccaaactgcctcatcatagacgctggtagt tttg ccatgacagcagttggattcgcctctcgagcaggatgctgtcccgtttcca tgtgatatcgttactaacggctacattgagccccgcccgcgaagtcgccatagg aacactacgccaatatttgaagtcacaaccgcgctttcacgagaa。

3 治疗方法

治疗牛巴贝斯虫病的原则是通过清除牛体内巴贝斯虫，使红细胞尽快恢复基础代谢功能。本次治疗选用的是三氮脒注射液（河北某兽药业有限公司；产品批号：2020012；注射剂，1 g/支），牛肌内注射，1 次量为3 mg/kg，1 日1 次，间隔24 h 可再次注射，但不得超过3 次。3 d 后患病牛有了明显好转。10 d 后全部治愈，精神状态、食欲以及体温均恢复正常。

4 讨论

4.1 防治

蜱虫是巴贝斯虫的中间宿主，经蜱虫叮咬是巴贝斯虫最常见的传播途径。蜱虫具有明显的季节性活动规律，多发生于每年的3—10 月。内蒙古的养殖场常选址于人烟稀少的荒滩，而这些地方也是蜱虫较为活跃的区域，针对这些问题应制定一套有效的牛巴贝斯虫防控措施。

首先要保持牛群饲养场区及圈舍卫生。将场区内的臭水沟等潮湿的地方用生石灰掩埋后再用泥土填平，以免天气炎热使得许多寄生虫的中间宿主再次繁殖；每天清理圈舍粪便，对卧床上的垫料、料道及饮水系统要定期清洗消毒、检查更换，以免时间长发霉滋生细菌[16]。清洁干净的环境能让动物处于一个舒适的状态，从而提高机体对外界的抗病能力。

对牛群要定期驱虫。寄生虫寄生方式主要分为两种：一种是体表寄生，另一种是体内寄生。体表寄生虫更多是体内寄生虫的一种传播媒介，寄生虫通过体表叮咬吸取血液获得营养，同时也将其体内其他寄生虫传播到血液中。对此可在体表寄生虫高发季节，在场区附近燃烧蒿草，通过烟雾达到驱虫的目的。也可以选择体表驱虫药（阿维菌素和伊维菌素等）进行药浴或者口服，每年2 次[17]。对于体内寄生虫则可以在其传播媒介活跃时期，对牛群进行抽样采血，通过简单的血涂片法进行鉴定，检查牛群血液中是否有虫体的存在。当有新的牛只购入时，首先要采血检测是否存在寄生虫，并对牛只进行体表驱虫，集中隔离饲养45 d 并检疫合格后再进行合群饲养[18]。

4.2 诊断

显微镜检查是诊断寄生虫病最常用的方法之一。然而，用显微镜对寄生虫识别和量化耗时且劳动密集，许多养殖场缺乏显微镜及具有相关技术的研究人员，以至于无法及时诊断体内寄生虫的种类，而引发驱虫药的滥用，因此更为方便、快捷以及成本低廉的诊断方法是兽医工作者研究的目标[19]。本次病例诊断中，除了显微镜检查外，还使用了血清学方法的ELISA 检测和分子生物学诊断的18S rDNA PCR 技术。后两种方法相对于显微镜检查能更有效地应用于临床实践诊断中，且结果更加准确[20]，能够辅助肉牛养殖场及时诊断并进行驱虫。

5 结论

通过对本次报告肉牛病例进行临床症状观察及实验室诊断，最终确诊为牛巴贝斯虫感染，并采用三氮脒治愈了该病。