丁酰基肉碱代谢异常新生儿的基因型和生化表型分析

吴鼎文，杨茹莱，方可欣，刘 晨，汤佳明，于美君，赵正言

浙江大学医学院附属儿童医院遗传与代谢科 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 浙江省新生儿疾病诊治重点实验室，浙江 杭州 310052

串联质谱法将传统的“一样本、一检测、一标志物、一疾病”筛查变成了“一样本、一检测、多标志物、多疾病”筛查，成为新生儿疾病筛查领域的关键技术［1］。基于干血斑进行C4 检测主要用于IBDD 和SCADD 的新生儿筛查［2］。但因C4 和异丁酰肉碱的质荷比相同，无法通过串联质谱法区分，故进一步的分型检测十分关键［3］。基因检测是对生化检测的有效补充，可提高遗传代谢病诊断的准确性，具有重要的临床应用价值［4］。基于靶向基因捕获的高通量测序是针对感兴趣的特定基因外显子区域定制探针，与基因组DNA进行杂交，经富集后利用高通量测序进行分析。由于测序的目标区域只占基因组的一小部分，因此可在保证获得足量目标基因变异信息的前提下，极大地降低测序成本。靶向基因捕获与高通量测序的组合应用既保留了信息自动化分析的优势，又避免检测过多冗余内含子区域，大大提高了基因缺陷疾病的检测效率［5-6］。当前，生化指标检测联合基因变异的筛查已成为新生儿疾病筛查的新趋势［7］。故明确基因变异型与生化表型的关系更显得必要和紧迫。迄今，对于新生儿疾病筛查中出现单纯性C4 增高的群体，其基因变异型与生化表型的关联性尚待进一步探讨。本研究回顾性分析了120 例单纯性C4 增高新生儿临床检测资料，通过靶向捕获目标基因联合高通量测序检测C4 代谢异常新生儿的基因变异情况，分析基因变异型与生化表型的关系，从而为新生儿遗传代谢病筛查及临床决策提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2018年1月至2023年6月在浙江大学医学院附属儿童医院经串联质谱法筛查结果为单纯C4增高的120例新生儿（男性63例，女性57例）初筛和召回复查的C4、C4/C3 检测数据。在法定监护人签署知情同意书后，采集C4增高新生儿及其父母EDTA 抗凝静脉血各1.0～2.0 mL，4 ℃保存备用。研究通过浙江大学医学院附属儿童医院医学伦理委员会审查（2018-IRB-076）。

1.2 主要仪器及试剂

Xevo TQD串联质谱系统为美国Waters公司产品；Nanodrop2000 超微量核酸蛋白测定仪为美国ThermoFisher Scientific 公司产品；HiSeq 2500NGS平台为美国Illumina 公司产品；3500XL 测序仪为美国ABI Life 公司产品；非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒为美国PerkinElmer公司产品；QIAamp DNA Blood Mini Kit 血液DNA提取试剂盒为德国Qiagen 公司产品；Qubit 双链DNA 检测试剂盒、BigDyeTMTerminator v3.1 循环测序试剂盒为美国Invitrogen 公司产品；Agencourt AMPure XP 磁珠为美国Beckman Coulter 公司产品；TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina®Kit 文库构建试剂盒、TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina®Kit标签试剂盒为美国Vazyme公司产品；High Sensitivity DNA Kit 检测试剂盒为美国Agilent 公司产品；DNA Quantification Standards and Primer Premix Kit 文库定量试剂盒为美国KAPA Biosystems 公司产品；LA PCRTMKit酶试剂盒为日本TaKaRa 公司产品；NucleoSpin®Gel and PCR Clean-up PCR 产物纯化试剂盒为德国Macherey-Nagel公司产品。

1.3 串联质谱法检测新生儿外周血C4 及结果判断

依据新生儿疾病筛查技术规范的要求采集干血斑，参考非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒说明书进行实验操作，于Xevo TQD 串联质谱系统进行检测。参考文献［8］中的方法收集C4和C4/C3检测数据。为消除不同时期C4检测的差异，获得C4水平在“同一平面”的比较分析，将C4 和C4/C3 检测数据换算成C4 增高倍数。根据C4 检测值参考范围（0.03～0.48 μmol/L）和C4/C3比值参考范围（0.04～0.46），C4增高倍数=（C4检测值÷0.48+C4/C3比值÷0.46）÷2。召回串联质谱初筛发现C4指标增高的新生儿，重新采样进行串联质谱检测，C4仍增高者确定为“C4增高”。

1.4 靶向捕获目标基因联合高通量测序检测基因变异

1.4.1 DNA提取 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit 血液DNA 提取试剂盒，按照说明书提取全血基因组DNA，采用紫外分光光度计和Qubit双链DNA检测试剂盒检测DNA浓度和纯度。

1.4.2 建库及测序 由美国Agilent 公司定制ACAD8和ACADS基因的外显子及邻近50 bp 区域的捕获探针，通过多重探针杂交方法靶向富集目标区域序列；Agencourt AMPure XP 磁珠纯化捕获产物。按照TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina®Kit文库构建试剂盒说明书处理纯化产物，建库过程中每个样本加上特殊标签。文库经Qubit及2100 Bioanalyzer进行浓度及片段大小质检分析确定合格后，利用DNA Quantification Standards and Primer Premix Kit 文库定量试剂盒进行文库精确定量并确定上机样本量，最后在HiSeq 2500平台进行测序反应。目标区覆盖度大于99.90%，目标区平均测序深度大于300次。

1.4.3 数据处理 将基因靶向高通量测序数据进行低质量过滤，以人类基因组hg19 为参考序列，通过BWA（Burrows-Wheeler Aligner）、Picard等生物信息软件进行序列比对及重复标记。采用GATK（The Genome Analysis Toolkit）、Samtools进行变异位点的识别［9］。采用Annovar 注释软件将变异位点注释到公共突变数据库，以变异位点的人群频率、序列保守性、变异所处的位置等条件进行筛选。

1.5 桑格测序检测基因变异的遗传来源

采用桑格测序对新生儿及其父、母亲进行候选变异位点的验证，以明确变异的遗传来源及顺式或反式。取50 ng DNA，使用待测位点的特异性引物，按照LA PCRTMKit 酶试剂盒操作流程进行PCR，并使用NucleoSpin®Gel and PCR Clean-up试剂盒纯化PCR产物。回收PCR产物按照BigDyeTMTerminator v3.1 循环测序试剂盒操作流程进行测序PCR 反应及纯化。纯化产物于ABI 3500XL 平台进行测序。测序结果采用SeqMan 软件进行序列比对分析。

1.6 蛋白功能域预测及基因变异的致病性评估

通过检索NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得ACAD8基因（NM_014384.3）和ACADS基因（NM_000017.4）的蛋白质序列。通过SMART数据库（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/change_mode.pl）对基因的蛋白质序列进行功能域预测。采用SIFT、Polyphen2_HDIV、Polyphen2_HVAR、LRT、MutationTaster、Mutation Assessor、FATHMM、PROVEAN、MetaSVM、MetaLR、REVEL等11个生物信息软件预测错义突变的危害性，并使用SpliceAI 软件预测变异是否影响基因剪切。在ClinVar、HGMD、LOVD 数据库中检索相关变异的收录和注释情况，在PubMed 数据库中检索相关变异的文献报道情况。参考ACMG 分类标准结合临床随访情况评估变异的致病性，具体分为“致病”、“可能致病”、“临床意义未明”、“可能良性”、“良性”五级［10］。评估为“致病”、“可能致病”、“临床意义未明”的基因变异纳入本次研究。

1.7 统计学方法

通过R 语言（https：//www.r-project.org/）编程。计量数据以均数±标准差（）表示，采用威尔科克森秩和检验进行数据分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单纯C4增高新生儿基因变异检测结果

在120 例C4 增高新生儿中，检出ACAD8基因和（或）ACADS基因变异117例（97.50%），均为遗传来源。ACAD8基因共检出32 种变异型，涉及23 种错义突变（71.88%）、5 种移码突变（15.63%）、3 种剪接突变（9.38%）和1 种同义突变（3.13%）。其中，c.244_245del（p.A82Pfs*22）、c.258del（p.F86Lfs*38）、c.121C＞T（p.L41F）、c.359C＞T（p.T120I）、c.887G＞A（p.R296Q）、c.947A＞C（p.Q316P）、c.986C＞T（p.A329V）未曾报道，根据蛋白功能域预测结果，这7个变异均位于功能域，前2种移码突变评估为“致病”，后5种错义突变评估为“临床意义未明”。ACAD8基因变异位点分布情况见图1。ACADS基因共检出41 种变异型，涉及38种错义突变（92.68%）、2种剪接突变（4.88%）和1 种整码突变（2.44%）。其中17 种变异型未曾报道，具体为c.79A＞C（p.T27P）、c.104C＞T（p.P35L）、c.233G＞A（p.G78E）、c.301G＞T（p.A101S）、c.346A＞G（p.M116V）、c.360+5G＞A、c.466G＞A（p.E156K）、c.586G＞A（p.V196M）、c.698T＞C（p.I233T）、c.820G＞T（p.G274C）、c.847G＞A（p.A283T）、c.862G＞T（p.D288Y）、c.968G＞A（p.S323N）、c.987G＞T（p.W329C）、c.1049T＞C（p.L350P）、c.1062G＞C（p.E354D）、c.1186G＞A（p.E396K），其中c.360+5G＞A 为剪接突变，其余均为错义突变；除c.79A＞C（p.T27P）外，其余均位于功能域；c.233G＞A（p.G78E）和c.1186G＞A（p.E396K）被评估为“可能致病”，其余15种均被评估为“临床意义未明”。ACADS基因变异位点分布情况见图2。上述结果提示，ACAD8基因和ACADS基因变异是导致新生儿血C4 增高的主要遗传学原因，错义突变是主要类型，且均存在高频变异型。

图1 本研究检出的32种ACAD8基因变异位点分布Figure 1 Distribution of ACAD8 genes variations detected in the study

图2 本研究检出的41种ACADS基因变异位点分布Figure 2 Distribution of ACADS genes variations detected in the study

2.2 不同基因型新生儿C4增高倍数比较

120 例新生儿中，检出ACAD8双等位基因变异39例，ACAD8单等位基因变异3 例，ACADS双等位基因变异34例，ACADS单等位基因变异36例，ACAD8和ACADS双 基因变 异5例，未检出基因变异3例。其中，ACAD8双等位基因变异组的C4增高倍数初筛值为3.39±0.97（1.64～5.35），召回值 为3.79±1.18（1.00～5.86，其中1例小于1.50）；ACADS双等位基因变异组的C4 增高倍数初筛值为2.63±0.95（1.53～5.79），召回值为2.90±1.25（1.29～6.16，其中4 例小于1.50）；ACADS单等位基因变异组的C4 增高倍数初筛值为1.42±0.35（0.87～2.49，其中27 例小于1.50），召回值为1.33±0.26（0.94～1.97，其中30 例小于1.50）。因ACAD8单等位基因变异及ACAD8和ACADS双基因变异的例数较少，不具备统计学分析价值，故不予分组分析。组间比较显示，ACAD8双等位基因变异组、ACADS双等位基因变异组C4 增高倍数初筛值和召回值均显著高于ACADS单等位基因变异组（均P＜0.01），且ACAD8双等位基因变异组C4 增高倍数初筛值和召回值较ACADS双等位基因变异组均更高（均P＜0.01），见图3，各例的基因型和C4 增高倍数见附表1。结果提示，检出双等位基因变异新生儿的C4 水平较单等位基因变异者高，且ACAD8变异者较ACADS变异者的C4水平更高；新生儿在初筛时，C4 增高倍数1.50 以上检出双等位基因变异的概率更高。

图3 不同基因型新生儿C4增高倍数比较Figure 3 Comparison of multiples of C4 reference range among different gene variations groups

3 讨论

采用串联质谱法检测新生儿干血斑中数十种氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平来筛查氨基酸代谢障碍、有机酸血症及脂肪酸氧化代谢障碍等多种遗传代谢病，已广泛应用于新生儿出生缺陷的防治［11］。C4 是串联质谱法新生儿筛查的重要指标，在IBDD、SCADD、乙基丙二酸脑病、Ⅱ型戊二酸血症和甲亚氨基谷氨酸尿症病例中均可出现C4 或C4 异构体的增高［2］。当前，国际上普遍采用流动注射式串联质谱法进行新生儿遗传代谢病筛查，可实现高通量，但无法分离C4 的异构体和同量异位化合物［3］。因此对C4增高新生儿进行后续的鉴别诊断十分重要。

既往研究表明，IBDD 和SCADD 均为常染色体隐性遗传病，分别由ACAD8和ACADS的双等位基因变异所致，串联质谱法检测均呈现单纯的C4增高［2］。在本研究队列的120 例单纯C4 增高的新生儿中，39 例检出ACAD8双等位基因变异，3 例检出ACAD8单等位基因变异，34 例检出ACADS双等位基因变异，36例检出ACAD8单等位基因变异（19 例为母源，17 例为父源），5 例检出ACAD8和ACADS双基因变异，说明单纯C4增高新生儿的遗传学原因复杂，ACAD8和ACADS基因的双等位基因变异、单等位基因变异及双基因复杂变异均可导致不同程度的C4 增高。本次检出的32种ACAD8基因变异型离散分布于1 至10 号外显子，错义突变占71.88%（23/32），其中c.286G＞A和c.1000C＞T 最常见，与Feng等［12］总结的情况类似。本次检出的41种ACADS基因变异型离散分布于2至10号外显子，以错义突变为主（92.68%）。其中c.1031A＞G、c.1130C＞T 和c.164C＞T 的检出频率较高，分别为27.27%（30/110）、14.55%（16/110）、9.09%（10/110）。而Zhang等［13］报道中国北方人群ACADS基因最常见变异型为c.1031A＞G（33.33%）和c.164C＞T（33.33%），而c.1130C＞T 仅检出2 次，提示ACADS基因变异存在一定地域特征，c.1130C＞T（p.P377L）可能是浙江地区人群特有的高频变异。在新近报道的50个ACAD8基因变异的病例中，合并报道了20 种新的变异型［12，14］。本次再增添7种未曾报道的ACAD8基因变异型和17种未曾报道的ACADS基因变异型，说明ACAD8和ACADS变异均具有高度异质性，可以预见随着高通量测序技术在遗传代谢病筛查和诊断中的广泛应用，将会出现更多新的变异型。

众所周知，在新生儿遗传代谢病筛查体系中，通过初筛时特定生化指标的差异来识别目标疾病高危人群是其核心内涵。那么初筛呈现C4增高的阳性预测值如何呢？Zhou等［2］报道经常规串联质谱法筛查，1029 名新生儿呈现C4 增高，通过二级筛查，初筛阳性儿降低至237名，但仅有17名获得了遗传学证据支持，说明现有串联质谱法新生儿筛查体系中C4 增高儿的假阳性问题突出。本研究对不同基因变异组C4 增高倍数进行比较分析结果显示，ACAD8和ACADS双等位基因变异群体的召回复测C4 水平整体高于初筛时期，但不同患者升高或降低均存在。Zhou等［2］基于17 例检出基因变异的C4 增高患儿进行分析，提示SCADD 患儿和IBDD 患儿间C4 水平没有差异。而本文资料显示ACAD8双等位基因变异组的初筛和召回复测C4 水平均显著高于ACADS双等位基因变异组和ACADS单等位基因变异组；ACADS双等位基因变异组的初筛和召回复测C4水平均显著高于ACADS单等位基因变异组。这是否意味着获得遗传学证据支持的患儿与缺乏遗传学证据支持患儿间的C4水平存在“分水岭”呢？本文资料显示，所有携带ACAD8双等位基因变异或ACADS双等位基因变异新生儿的初筛C4 增高倍数均大于1.50，而ACADS单等位基因变异仅有约25%（9/36）的初筛C4 增高倍数大于1.50，提示常规串联质谱法新生儿筛查呈现为单纯的C4 增高时，其“筛查切值”可以适当提升，以减少假阳性病例。

综上所述，靶向捕获疾病基因联合高通量测序能高效探查C4代谢异常儿的遗传学背景，可推荐为串联质谱法筛查阳性患儿临床鉴别及分型诊断的首选方法。本文资料提示ACAD8和（或）ACADS基因变异是新生儿C4 增高的主要遗传学原因，拓展了ACAD8、ACADS的基因变异谱。新生儿串联质谱法筛查呈现单纯的C4增高时，其筛查切值建议适当提升，但合适的切值有待后续研究。

本文附表见电子版。

志谢本研究得到了国家重点研发计划（2022YFC2703401）和浙江省重点研发计划（2021C03099）的资助

AcknowledgementsThis study was supported by the National Key R&D Program of China (2022YFC2703401),and Key R&D Program of Zhejiang Province (2021C03099)

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

©The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)