反复着床失败患者的临床病例对照研究

贾婉璐 王海燕 乔杰 刘平 李蓉 陈新娜 王颖

不孕症是生殖领域内全球性的医学问题,近年其发病率在全世界呈上升趋势[1-2]。辅助生殖技术的发展成为治疗不孕症的重要方法,实现了许多不孕女性为人母的愿望。然而,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)周期的着床率始终徘徊在30%～40%,其中反复着床失败(recurrent implantation failure,RIF)的发生率约在5%～11.1%[2],成为困扰临床工作的一大难题。

反复着床失败自提出以来并无统一的诊断标准,目前公认的定义为:不孕女性至少连续行3个胚胎移植周期(新鲜或解冻移植周期)且每周期移植1～2枚优质胚胎未获得临床妊娠,或者不孕女性经历2～6个IVF-ET周期且共移植≥10枚形态学上的优质胚胎仍未获得临床妊娠[2-3]。反复着床失败的发病机制、高危因素尚不明确,目前根据胚胎着床机制将RIF的病因分为三大类即母体因素、胚胎因素及母胎界面免疫因素。因此,RIF的临床治疗方法也是从这三方面入手,如清除宫腔病变、提高子宫内膜容受性、辅助孵化、囊胚移植及免疫治疗等。

虽然以上方案可一定程度地改善了部分RIF患者的着床率和妊娠率,但仍然有许多病人经过这些治疗后再次失败,因此临床医生非常有必要继续寻找RIF的相关病因,而且以上干预方案大多是在患者诊断为RIF后进行的,在临床工作中,医生迫切需要知道RIF的预警因素,以提高诊治意识。本次研究通过分析RIF患者与同期行第一次IVF助孕即成功的患者的病例资料,旨在研究RIF是否与不孕症病因及其IVF-ET治疗中的临床因素相关,以期早期识别RIF的高危因素,并减少反复着床失败的发生率。

对象与方法

一、研究对象

2015年01月—2016年01月在北京大学第三医院生殖中心行IVF助孕,患者至少连续行3个胚胎移植周期(新鲜或解冻移植周期)且每周期移植1～2枚优质胚胎未获得临床妊娠,且年龄小于41岁的共204例,排除既往在其它医院行IVF助孕的患者8例,共入组196例,作为反复着床失败组(RIF组)。

与RIF患者在同年同月行第一次IVF助孕并成功分娩的患者共1 508例,按照1:2匹配原则和入选标准共选取对照组392例。本研究对照组患者纳入标准:(1)与RIF患者同年同月在北京大学第三医院生殖中心第一次行IVF-ET助孕;(2)第一次IVF-ET助孕即成功获得妊娠并分娩;(3)年龄小于41岁;(4)与RIF患者在同天取卵且试管编号最近的两例。同样排除既往在其他医院行IVF助孕的患者。

二、研究方法

1.资料来源:采用临床资料的病例对照研究方法,RIF组及对照组患者第一次IVF周期时的信息从北京大学第三医院生殖中心数据库中获取,病例的其余信息在北京大学第三医院病案室检索获得。

2. 主要分析指标:(1)患者第一次IVF助孕时的一般情况及辅助检查资料:年龄、身高、体重、体重指数(body mass index,BMI)、丈夫年龄、不孕类型、不孕年限、基础激素水平(b-PRL、b-FSH、b-LH、b-E2、b-A)、基础窦卵泡数(b-antral follicle)、IVF周期月经第二天的激素水平(M2-FSH、M2-LH、M2-E2、M2-P)、甲状腺自身免疫抗体(TGAb、TMAb)、血型。(2) 行IVF助孕的病因:输卵管因素、无排卵性不孕(除1例高泌乳素血症外均为PCOS病人)、男方因素、子宫内膜异位症、卵巢储备功能下降及不明原因不孕[4-10]。(3)第一次IVF周期的相关资料:HCG日内膜厚度、HCG日内膜分型、促排卵方案、获卵总数、受精方式、2PN数、2PN受精率、优质胚胎数、优质胚胎率[11-13]。

3. 统计方法:采用SPSS 17.0进行数据分析。计量资料经正态性检验,基础E2水平、月经第二天E2水平、Gn用量、IVF-2PN率、ICSI-2PN率、总2PN率及优质胚胎率不符合正态分布,以中值表示并行秩和检验;其余计量资料均符合正态分布,以均值+标准差表示、应用t检验分析;计数资料卡方检验分析,多因素分析应用Logistic回归分析,P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、患者第一次移植周期的基础资料

196例RIF患者既往行IVF失败次数为(3.80±0.987)次、既往共移植胚胎数(6.65±2.10)个。RIF组的患者年龄及丈夫年龄均大于正常对照组,差异有统计学意义,而身高、体重、体重指数、不孕类型、不孕年限在两组间无统计学差异。

两组患者第一次行IVF助孕时,RIF组196例患者中无微刺激方案取卵者;仅有1例患者为自然周期取卵,未用Gn;有1例患者未取到卵细胞,有1例患者的丈夫未取到精子,未受精,因此计算2PN数、优质胚胎数、2PN率及优质胚胎率时排除此2例患者及其相对应的4例对照组患者。RIF组有9例患者未形成2PN受精卵,有44例患者未形成优质胚胎。对照组392例患者均有2PN受精卵形成,但17例患者无优质胚胎形成。分析两组患者的第一次IVF助孕时的辅助检查资料及IVF周期相关资料分析,结果显示基础FSH水平、内膜厚度、内膜分型、Gn用量、优质胚胎数、ICSI-2PN率、总2PN率及优质胚胎率在两组间均有显著差异,而其他统计指标均无差异性,具体见表1。

表1 RIF组和对照组的基础资料分析[例(%)]Table 1 Basic data analysis of RIF group and control group[n(%)]

二、不孕病因分析

将患者合并的不孕病因分为输卵管因素、无排卵性不孕、男方因素、不明原因不孕、卵巢储备功能下降、子宫内膜异位症(有34例为卵巢巧克力囊肿,其中19例经过腹腔镜手术;有15例子宫腺肌症、其中4例同时合并卵巢巧囊)六类。经卡方检验分析发现卵巢功能下降和子宫内膜异位症在两组间有显著性统计学差异,具体见表2。

表2 RIF组和对照组的不孕因素分析[例(%)]Table 2 Analysis of the infertility factors between two groups[n(%)]

根据患者合并不孕因素的个数,将两组中患者分为合并1个不孕因素的的患者、合并2个不孕因素的患者,合并≥3个不孕因素的患者。经卡方检验,发现不孕因素个数在两组间有显著统计学差异,具体见表2。

三、年龄分层分析

根据患者年龄将患者分为3组:年龄≥35岁、30≤年龄<35岁、年龄<30岁。年龄≥35岁组患者共161例,其中反复着床失败患者有74例,单因素分析以上资料发现仅丈夫年龄、ICSI-2PN率在RIF组和对照组间有统计学差异。30≤年龄<35岁组患者共264例,其中反复着床失败患者有86例,单因素分析结果无排卵性不孕、男方因素、优质胚胎数、总2PN率、IVF-2PN率、ICSI-2PN率及优质胚胎率在两组间有统计学差异。年龄<30岁组患者共163例,其中反复着床失败患者有36例,单因素分析结果雄激素水平、内膜厚度、获卵总数及2PN数在两组间有统计学差异。具体结果见表3。

表3 三组患者的临床因素分析Table 3 Analysis of clinical factors between three groups

四、多因素回归分析

根据单因素分析结果及统计学原理将女方年龄、丈夫年龄、基础FSH水平、卵巢功能下降、子宫内膜异位症、不孕因素个数、Gn用量、内膜厚度、内膜分型、优质胚胎数、总2PN率及优质胚胎率进行回归分析,结果发现丈夫年龄、子宫内膜异位症、内膜形态、优质胚胎率及总2PN率均为反复着床失败的独立影响因素,其中丈夫年龄和子宫内膜异位症是反复着床失败的危险因子,A型内膜、优质胚胎率及总2PN率则是反复着床失败的保护因子。具体见表4。

表4 RIF组和对照组间多因素回归分析Table 4 Logistic regression analysis between the two groups

讨 论

一、重视对男性生育年龄的评估

研究已证实女性年龄≥35岁是不孕症及许多妊娠并发症的高危因素。而男性年龄对生育的影响却未受到相应的重视。一方面由于没有明确的男性影响生育的临界年龄,另一方面是男性年龄对生育的影响仍存在争议。而本次研究结果支持男方年龄对IVF周期的临床结局有影响。入组的196例反复着床失败患者的丈夫平均年龄为35.53岁,年龄最小为21岁,最大为55岁。而对照组392例不孕患者的丈夫平均年龄为32.26岁,其中年龄最小为22岁,最大为50岁。回归分析发现丈夫年龄是反复着床失败的独立影响因素(P<0.01,OR=1.112),即男方年龄越大,发生反复着床失败的风险高。

一直以来关于男方年龄与辅助生殖临床结局是否相关存在争议,但2022年[14]最新发表的一篇Meta分析显示高龄男性与ART临床结局呈负相关,且男方年龄在总体妊娠率、流产率及活产率的临界年龄为35岁,而在临床妊娠率的临界年龄为40岁。很多的研究表明男性年龄越大,其精液的量和精子活力越低、二倍体精子的量越高[15-18],研究还发现年龄大的男性,其发生精子DNA损伤的风险越高[17][18],且男性的年龄对精子DNA的完整性比常规的精液参数更为重要[19]。而2017年[20]及2021年[21]发表的Meta分析均显示精子的DNA损伤与辅助生殖技术的妊娠结局呈负相关。由此可见,男方年龄对IVF的成功有至关重要的作用。

二、警惕子宫内膜异位症

本研究发现子宫内膜异位症是RIF发生的高危因素(P=0.017,OR=2.47),即合并子宫内膜异位症的不孕患者在辅助生殖助孕过程中易发生RIF。

已有很多研究证实了子宫内膜异位症与女性不孕相关。子宫内膜异位症引起不孕的原因包括卵巢功能下降、排卵障碍、输卵管拾卵障碍、影响精子的运动、影响受精过程、影响胚胎的转运及改变盆腔微环境等[22-25]。子宫内膜异位症的女性有30%～50%合并不孕,这个比率在曾行ART的不孕女性中高达80%,而在反复妊娠丢失的女性中有20%～40%合并子宫腺肌病[23]。虽然辅助生殖技术助孕成为治疗不孕症合并子宫内膜异位症、尤其是中重度内异症的重要治疗方法,并取得了一定疗效[26-27]。但Meta分析显示子宫腺肌病与IVF妊娠结局呈负相关,其临床临床妊娠率、活产率均低于没有子宫腺肌病的女性,而胚胎着床率、流产率高于无子宫腺肌病的女性[24-25]。子宫内膜异位症和子宫腺肌病可以通过改变子宫内膜容受性、影响胚胎质量及引起机体免疫环境变化等引起反复着床失败[28-29],这与本研究的结论相符合。

三、提高卵母细胞受精率及胚胎质量

本研究结果显示患者IVF周期形成的优质胚胎数、优质胚胎率、ICSI-2PN率及总2PN率在RIF组和对照组间有显著差异,且优质胚胎率及总2PN率是RIF发生的保护因素,即2PN率高、优质胚胎率高的患者容易获得妊娠。

精子质量是受精成功的关键因素,ICSI技术赋予精子激活卵母细胞的能力,是治疗男性重度少精、弱精、畸精和能够通过手术获取精子的无精症的主要方法,可提高男性不育的受精率[30],不仅适用于治疗男性不育的患者,对其它原因不孕的患者同样适用[31]。在ICSI基础上人们还开展了卵胞浆内形态选择单精子显微注射技术(IMSI,intramorphology sperm injection),虽然Gatimel等[32]人的研究显示IMSI并不能改善曾有两次ICSI移植失败患者的临床结局,但很多的研究证实IMSI技术可提高既往ICSI移植失败患者胚胎着床率、临床妊娠率[33]。因此,还需要更多高质量的的研究支持IMSI在RIF患者中的应用价值。

卵母细胞的成熟也是受精及早期胚胎发育的关键[34]。对于有IVF/ICSI病史的患者要考虑到会有不满意的卵母细胞获取率[35],且ICSI受精成功也离不开卵母细胞的激活,Yanagida等[36]人的研究表明缺乏卵母细胞激活会导致多数ICSI受精失败。

因此,建议对于在第一个IVF周期中总2PN率低和或优质胚胎率低,尤其是年龄较大、合并子宫内膜异位症的患者,给予相应治疗提高患者再次移植周期的受精率和胚胎质量,以期减少反复着床失败的发生。

四、建议A型内膜周期移植

本次研究发现内膜厚度、内膜形态在RIF组和对照组中有显著差异,经多因素回归分析显示B型内膜患者较A型内膜患者更易发生反复着床失败(P=0.016,OR=0.487),可见A型内膜时移植可减少反复着床失败的发生。此外,本次研究入组的588名患者中仅7名患者内膜厚度>14 mm,仅3例患者<7 mm,其余患者内膜厚度均在7～14 mm。

研究发现内膜厚度>7 mm患者的胚胎着床率高于<7 mm的患者[11]。2019年Meta分析显示HCG内膜厚度在6 mm以上预测患者的活产率的敏感性达99.9%[38]。该文章还发现A型内膜对IVF助孕患者的临床妊娠率无预测意义[38]。但2021年的一项纳入了12 991个新鲜移植周期的大样本研究表明当内膜厚度在14 mm以下时,A型内膜患者的临床妊娠率高于B型内膜患者,且具有统计学差异[39]。以上研究纳入的均不是RIF的患者,因此关于内膜厚度、内膜形态对RIF患者的影响仍需进一步高质量研究。

五、年龄分层化管理

Ocal等[40]人的研究表明年龄≥35岁不仅是不孕症的高危因素,也是反复着床失败的高危因素。分层分析发现对于年龄≥35岁的患者,丈夫年龄、ICSI-2PN率在RIF组和对照组间有显著差异,因此对于年龄≥35岁的患者不仅要改善卵母细胞质量,也要提高患者的丈夫的精液质量,进而提高患者的2PN率来减少RIF的发生。

对于30≤年龄<35岁组的患者,年龄不再是RIF发生的高危因素,反而是无排卵性不孕(主要为PCOS)、男方因素、2PN率及优质胚胎的数量和比例成为RIF的影响因素。因此针对此人群患者临床医生应对PCOS及男性因素在IVF助孕前进行预处理,改善基础病情,个体化治疗来减少RIF的发生。

而年龄<30岁RIF患者的获卵数、2PN数均高于对照组而内膜厚度低于对照组,考虑常规剂量的促排卵方案对年轻病人可获取较多数量的卵母细胞,有较高的E2水平进而导致内膜容受性的下降,应采用温和的卵巢刺激方案获取适当数量的卵母细胞,降低过高的雌激素对内膜容受性的不良影响,并保证胚胎的质量。此外,本研究的雄激素为雄烯二酮,结果显示高雄烯二酮水平与RIF发生相关。不同种类的雄激素有不同作用[41],睾酮和脱氢表雄酮可提高卵巢储备功能下降患者卵巢功能,但其他雄激素(雄烯二酮和脱氢睾酮)可能产生相反作用[42]。目前尚未见到雄激素和反复着床失败的相关研究,仍需进一步探索。